Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 3
Описание файла
PDF-файл из архива "Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
СвязываниеДНК напрямую было показано только для белка Rif1 человека [37], однако предполагают, чтодрожжевые гомологи Rif1 способны связывать ДНК, несмотря на низкую консервативностьДНК-связывающего домена [36]. Белки Rif2 и Sir3 присутствуют только в S.
cerevisiae (и оченьблизких им видах) [10].Гомологи компонентов комплекса CST (Cdc13, Stn1 и Ten1) были идентифицированы вовсех видах почкующихся дрожжей (с известной последовательностью генома), за исключениемY. lipolytica. Cdc13 из S. cerevisiae имеет 5 доменов [3, 22]: N-концевой OB1 необходим длядимеризации ScCdc13 и привлечения Pol1 (репликативной полимеразы), домен RD (recruitmentdomain) обеспечивает взаимодействие Est1-Cdc13, предположительный OB2 домен снеизвестной функцией, OB3 – ДНК-связывающий домен, OB4 каким-то образом участвует врегуляции длины теломер.
Любопытно, что C. albicans (и некоторые другие виды рода Candida)имеют два гомолога белка Cdc13 (CaCdc13A и CaCdc13B). Оба эти гомолога короче, чемScCdc13; они отличаются от последнего отсутствием двух N-концевых OB доменов (и11находящегося между ними домена RD). Как CaCdc13A, так и CaCdc13B являютсякомпонентами теломерного хроматина, поскольку они связывают теломерную G-цепь in vitro иin vivo, а удаление каждого из генов CaCDC13A и CaCDC13B приводит к нарушению регуляциидлины теломер [38, 39].2.1.2.
Теломераза почкующихся дрожжейОсновными компонентами теломеразного комплекса во всех организмах являютсятеломеразная РНК (TR) и теломеразная обратная транскриптаза (TERT) (в S. cerevisiae – TLC1 иEst2, соответственно). Этих компонентов достаточно для активности теломеразы in vitro [40].In vivo же для работы теломеразы необходима помощь некоторых вспомогательных белков. Дляразличных типов организмов набор таких вспомогательных белков сильно отличается. ВS. cerevisiae дополнительными компонентами теломеразного комплекса являются Est1, Est3,Ku70/Ku80 и семь Sm-белков [3]. Est1 необходим для привлечения теломеразы на теломеры засчёт взаимодействия с белком Cdc13 [41].
Вдобавок, Est1 важен для стимуляции активностителомеразы [42]. Функция белка Est3 гораздо менее понятна. Считается, что он участвует вактивации теломеразы, а также регулирует взаимодействие теломеразы с ДНК (возможно, вобласти якорного сайта) за счёт взаимодействия с N-концевым доменом белка Est2 [43, 44].Ku70/Ku80 отвечает за транспорт TLC1 в ядро, так как он может связываться с теломернойДНК и с TLC1, но только не одновременно [45]. Sm-белки образуют гептамерный комплекс ввиде кольца, который связывается около 3'-конца TLC1 и необходим для стабильностителомеразной РНК [46].Последовательности теломеразных РНК из разных организмов обладают крайне низкойстепенью гомологии. Несмотря на это, гены соответствующих TR были идентифицированы вомногих видах почкующихся дрожжей.
Описанные в литературе дрожжевые теломеразные РНКимеют схожее строение, у всех можно выделить несколько консервативных структурныхэлементов: матричный участок, граничный элемент (TBE, template boundary element),псевдоузел и тройная спираль, трёхсторонняя шпилька (TWJ, three way junction) и Est1связывающая шпилька [47, 48]. Исключение составляет только шпилька, отвечающая завзаимодействие с белками Ku70/Ku80 – эта структура присутствует только в TLC1 ителомеразных РНК ближайших родственников S. cerevisiae [49]. Белковые компонентытеломеразных комплексов (Est2, Est1 и Est3) относительно консервативны и присутствуютпрактически во всех видах почкующихся дрожжей. Исключением являются два вида Candidaparapsilosis и Lodderomyces elogisporus: в их геномах отсутствуют гомологи белка Est1. К томуже, белки Est3 из этих организмов имеют добавочные N- и C-концевые домены, значимостькоторых пока неясна [43].122.1.3.
Регуляция длины теломер Saccharomyces cerevisiaeРегуляция работы теломеразы по клеточному циклуЭксперименты по иммунопреципитации хроматина (ChIP) показывают, что в S.cerevisiae Est2 и TLC1 присутствуют на теломерах в течение практически всего клеточногоцикла, хотя есть два пика повышенной ассоциации: в G1 и поздней S фазах [50]. Связывание вG1 фазе зависит от взаимодействия TLC1-Ku80 [51], тогда как ассоциация с теломерами в Sфазе – от взаимодействия Cdc13-Est1 [52]. Ассоциация TLC1 с теломерами в G1 фазе нужна длянакопления и удерживания теломеразы в ядре [45]. Действие же теломеразы происходит тольков поздней S фазе клеточного цикла после завершения репликации теломерной ДНК [53].
Этосогласуется с тем, что необходимые для работы теломеразы in vivo Est1 и Est3 обнаруживаютсяна теломерах только в поздней S фазе [50, 54]. Белки Rif1 и Rif2 каким-то образом регулируютэтот процесс: при их удалении теломераза может работать и в G1 фазе [55]. Вероятно, этосвязано с формированием структуры высшего порядка теломер этими белками [31].Модель "счёта белков"Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что некаждая теломера удлиняется при клеточном делении, причём предпочтение отдаётся болеекоротким теломерам. Во-первых, скорость удлинения теломеразой (количество добавленныхнуклеотидов/число клеточных делений) зависит от длины теломер: по мере увеличения длинытеломер скорость их удлинения падает [56].
Во-вторых, вероятность быть удлинённой выше длякороткой теломеры, чем для более длинной [57]. Хотя количество добавляемых нуклеотидов независит от исходной длины. Результаты ChIP также показывают предпочтительную ассоциациюEst1 и Est2 с короткими теломерами в поздней S фазе [58, 59]. Наконец, наблюдения заединичными молекулами TLC1 в живой клетке методом микроскопии позволили сделатьпредположение, что синтез теломерной ДНК теломеразой в клетке – событие локализованное иорганизовано в специфические кластеры (называемые T-rec). Каждый их таких кластеровсодержит всего несколько теломер и несколько молекул теломеразы.
Причём, клетки, вкоторых искусственно повышено содержание коротких теломер, число T-rec возрастает [55].Описанные выше результаты хорошо укладываются в так называемую модель "счётабелков", более десяти лет назад предложенную для объяснения ингибирующего эффекта белкаRap1 (и его партнёров Rif1 и Rif2) на длину теломер [60]. Согласно этой модели количествосвязанного теломерой Rap1 определяет способность этой теломеры быть удлинённойтеломеразой: длинные теломеры связывают больше молекул Rap1, что в свою очередь приводитк формированию структуры, блокирующей теломеразу ("закрытое" состояние). Короткие13теломеры, следовательно, находятся в "открытом" состоянии доступном для действиятеломеразы (Рисунок 2.4).
Было предложено, что в передаче сигнала от Rap1 теломеразеучаствует белок Cdc13.Рисунок 2.4. Модель «счёта белков».Дальнейшие эксперименты привели к прояснению деталей предложенной модели. Такнапример, было показано, что действие белка Rap1 на длину теломер полностью зависит отбелков Rif; а следовательно на самом деле ведётся счёт связанных Rif1 и Rif2, а не Rap1, и рольRap1 заключается в привлечении Rif белков на теломеры за счёт взаимодействия с его Сконцом [61]. В свою очередь ингибирующее действие, оказываемое Rif белками, опосредованокиназой Tel1 (гомолог АТМ киназы человека) [62].
Tel1 – положительный регулятор длинытеломер, поскольку теломеры сильно укорачиваются при удалении соответствующего гена [63].Как и в случае двуцепочечных разрывов ДНК Tel1 привлекается на теломеры посредствомвзаимодействия с С-концом белка Xrs2 – субъединицы комплекса MRX. Как MRX, так и Tel1связываются с короткими теломерами [58, 64, 65]. Белок Rif2 конкурирует с Tel1 за связываниеС-конца Xrs2, нивелируя таким образом ассоциацию Tel1 с длинными теломерами.
Rif1 тожеучаствует в ингибировании накопления Tel1 на теломерах, однако механизм такогоингибирования до сих пор не понятен. Более того, этот эффект слабее, чем Rif2, и частичнозависим от последнего [66]. Стоит отметить, что в клетках штамма Δrif1 теломеры длиннее, чемв штамме Δrif2 [15]. Таким образом, негативный эффект белка Rif1 на длину теломер не можетбыть полностью объяснён ингибированием ассоциации Te1l с теломерами. В штамме Δtel1связывание MRX с ДНК нарушается Rap1 белком независимо от наличия белков Rif.14Предполагается, что Rap1 смещает MRX комплекс с теломер, если ассоциация Tel1 стеломерами блокирована белками Rif1 и Rif2 [66].Tel1 киназа важна для нормальной ассоциации теломеразы с теломерами [67].
Этообъясняют положительным влиянием киназы Tel1 на взаимодействие Cdc13-Est1, причёмсчитается, что мишенью фосфорилирования является белок Cdc13 [68]. Однако, существуюттолько противоречивые данные о возможной модификации Cdc13 киназой Te1l [3, 69].Альтернативная модель действия Te1l была предложена H. Gao и соавторами [70]: отсутствиеTel1 приводит к нарушению процессинга С-цепи теломер, в результате чего субстрат длятеломеразы оказывается неоптимальным. Модель может быть дополнена тем фактом, что Tel1улучшает связывание MRX с теломерами, делая его устойчивым Rap1-зависимомуингибирующему действию [66].
Согласно этой модели, действие теломерных белковнаправлено скорее в сторону ингибирования ассоциации MRX с теломерами, чемвзаимодействию Tel1 с теломерами. Эту гипотезу поддерживает тот факт, что клетки Δtel1 (скороткими теломерами) содержат меньше теломерной оцДНК, тогда как клетки с тройноймутацией А2287V/I2336T/K2751R в Tel1 (с удлинёнными теломерами) содержат большетеломерной оцДНК [71]. Однако, несмотря на то, что MRX и Tel1 действуют по одному и томуже пути в регуляции длины теломер, и теломеры в штаммах Δmre11 и Δtel1 cells одинаковокоротки, клетки Δmre11 содержат больше оцДНК, чем Δtel1 [72]. Значит стимуляция MRXзависимого образования теломерной оцДНК не может полностью объяснить функции Tel1киназы в контроле длины теломер [72].Стоит отметить, что некоторые экспериментальные факты не очень хорошоукладываются в модель "счёта белков" в том виде, как она представлена выше.
Во-первых,суперэкспрессия Rif1 и Rif2 в штамме с удлинёнными теломерами за счёт удаления Сконцевого домена Rap1 приводит к укорочению теломер, что говорит о возможности Rif белковвыполнять свою функцию независимо от Rap1 [61]. Во-вторых, короткие теломеры содержаттакое же количество Rif1, как и длинные [58]. Если учесть слабое и Rif2-зависимоеингибирование теломерной ассоциации Tel1, то механизм действия Rif1 совершенно непонятен.Rif1 может ингибировать накопление RPA и последующее развитие ответа на поврежденияДНК на дисфункциональных теломерах (например, при мутации в каком-либо теломерномбелке), скорее всего за счёт конкуренции с RPA за связывание оцДНК [73].
RPA такжеучаствует в привлечении теломеразы на теломеры [74]; тогда можно предположить, что нанормальных теломерах функцией Rif1 является нарушение связывания RPA. Более того, былопредложено, что Rif1 подобным образом может маскировать теломерный 3'-выступающийконец от теломеразы [73] – это предположение также частично объясняет функцию Rif1.15Другие механизмы контроля длины теломер S. cerevisiaeНесмотря на то, что Rap1-Rif1-Rif2-зависимое ингибирование MRX/Tel1 связывания стеломерами является основным путём регуляции работы теломеразы в S.