Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 6
Описание файла
PDF-файл из архива "Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 6 страницы из PDF
Последней деталью механизма является тот факт,что Taz1, Rap1 и Poz1 ингибируют фосфорилирование Ccq1.Рисунок 2.12. Фосфорилирование Ccq1, как ключевой элемент в привлечениителомеразы на теломеры S. pombe [4].Дополнительнымподтверждениемописанногомеханизмаявляютсянедавниеэксперименты с мутантами Tpz1, не приводящими к полной потере функции белка [121]. Так,нарушение взаимодействий Tpz1-Pot1 и Tpz1-Poz1 приводило к удлинению теломер, исоответствующие мутации находились в одном и том же регуляторном пути, что и Rap1 и Poz1.Однако, неожиданные результаты были получены при изучении мутации L449A в Tpz1,нарушающей взаимодействие Tpz1-Ccq1.
Оказалось, что несмотря на схожие фенотипы штаммаΔccq1 и штамма с мутацией L449A в Tpz1 (короткие теломеры и активация сигнальных путейрепарации ДНК), ассоциация Ccq1 или теломеразы с теломерами в штамме с мутацией L449A вTpz1 не нарушается. Это говорит, во-первых, о существовании альтернативного путипривлечения Ccq1 (а, следовательно, и теломеразы) на теломеры (не за счёт взаимодействийCcq1-Tpz1-Pot1).
Во-вторых, о новой критичной функции Ccq1 – активация каким-то образомкомплекса теломера-теломераза за счёт взаимодействия Ccq1-Tpz1. Предположительно, такая28активация происходит за счёт пострансляционной модификации Tpz1, разрушающейингибирующий теломеразу белковый мостик, соединяющий дцДНК и оцДНК теломер. Сучётом этих выводов модель регуляции длины теломер S. pombe должна быть несколькоизменена (Рисунок 2.13).Рисунок 2.13. Альтернативная роль Ccq1 в привлечении теломеразы на теломерыS.
pombe [121].Однако, многие аспекты остаются невыясненными в предложенной модели регуляциидлинытеломер.Например,какимименнообразомTaz1-Rap1-Poz1ингибируютфосфорилирование Ccq1 по остатку Thr93? Какое место занимает в данной модели белок Rif1,ассоциированный с Taz1 и негативно влияющий на длину теломер? Мутации некоторых другихбелков также влияют на длину теломер, но не задействованы в данной модели. Например,мутации в полимеразе лидирующей цепи Polε приводят к укорочению теломер, тогда какмутации в полимеразах отстающей цепи Polα и Polδ приводят к удлинению теломер [122].Более того, степень ассоциации с теломерами в разных фазах клеточного цикла не одинакова увсех компонентов теломерного комплекса, а значит, мостик из теломерных белков может насамом деле не образовываться in vivo или образовываться только на маленьком отрезкеклеточного цикла [120, 123].Попытка ответить на эти вопросы и построить более «динамическую» модель регуляциителомер (Рисунок 2.14) была предпринята в недавней работе [123].
Одним из важных событийдля привлечения теломеразы является накопление Ccq1-Tpz1-Pot1 комплексов на теломерах вS-фазе клеточного цикла. Однако, центральным событием в данной модели является прибытиерепликативных полимераз на теломеры. До этого было обнаружено, что полимеразалидирующей цепи Polε появляется на теломерах несколько раньше, чем полимеразы отстающейцепи Polα и Polδ [124]. Более раннее появление Polε приводит к накоплению оцДНК, и как29следствие к накоплению RPA и Rad3 киназы, фосфорилированию Ccq1 по остатку Thr93 ипривлечению теломеразы. Белки Rap1 и Poz1 стимулируют привлечение полимераз отстающейцепи, что объясняет их негативное действие на теломеразу. Taz1 влияет, как на время прибытияPolα и Polδ (положительно, через Rap1 и Poz1), так и на Polε (отрицательно). Отрицательноевлияние Taz1 на прибытие Polε предположительно опосредуется белком Rif1, посколькупоследний был задействован в регуляции времени "разгорания" ориджинов [125, 126].Обнаружено, что количество Taz1 на теломерах уменьшается при наступлении S-фазы, что"запускает" репликацию теломер.
При этом короткие теломеры должны реплицироватьсяраньше, поскольку содержат меньше Taz1, и накапливать больше RPA и Rad3 киназы ителомеразы. Ещё одним аспектом регуляции в данной модели является взаимодействие Tpz1 сдвумя компонентами CST комплекса – Stn1-Ten1. Предполагается, что это взаимодействиеспособствует привлечению Polα и ингибированию теломеразы. Важность этого взаимодействиябыла продемонстрирована в двух других работах [127, 128].Показано, что Tpz1модифицируется SUMO белком по остатку Lys242, такое сумоилирование Tpz1 повышает егосродство к Stn1, а нарушение этой модификации приводит к увеличению длины теломер.30Рисунок 2.14. «Динамическая» модель регуляции длины теломер S.
pombe [123].312.3. Регуляция длины теломер человека (Homo sapiens)2.3.1. Строение теломер человекаТеломерная ДНК млекопитающих и других позвоночных состоит из повторов TTAGGG[129, 130]. Эта последовательность составляет теломеры многих организмов на всех ступеняхэволюции: в том числе некоторых простейших, растений и грибов; предполагают, что TTAGGGявляется предшественником всех остальных теломерных повторов [131].Как уже упоминалось, белковый состав теломер человека и S. pombe имеет много общего(сравните Рисунок 2.10 и Рисунок 2.15).
Так, теломеры человека связываются комплексом изшести белков под названием "шелтерин" (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1, POT1) [132].Двуцепочечная часть теломер покрыта гомодимерами белков TRF1 и TRF2 – оба белкасвязывают ДНК при помощи MYB домена. Димеры TRF1 и TRF2 взаимодействуют междусобой и вместе связывают белок TIN2. POT1 – фактор, связывающий одноцепочечную частьтеломер. TPP1 – белок, взаимодействующий с POT1 и усиливающий его сродство к ДНК. TPP1взаимодействует с TIN2. Таким образом, двуцепочечная и одноцепочечная часть теломерыоказываются связаны цепочкой белок-белковых взаимодействий, как и в случае делящихсядрожжей.
Белок Rap1 также является компонентом теломерного хроматина, однако в отличиеот теломер S. pombe, Rap1 человека не участвует в образовании белкового мостика – онассоциирован с теломерами за счёт взаимодействия с TRF2.Рисунок 2.15. Строение теломер человека.Одноцепочечная часть теломер связана и защищена белком Pot1, что напоминаетситуацию в S. pombe и отличается от ситуации в почкующихся дрожжах, где фактором32связывания теломерной оцДНК является компонент комплекса CST – Cdc13. Однако, равно каки в S. pombe два других компонента CST – Stn1 и Ten1 имеют гомологов и участвуют впроцессинге теломер человека.
Более того, в отличие от S. pombe, третий компонент комплексаCST в человеке был идентифицирован – белок CTC1, хотя он не является настоящим гомологомCdc13 [133].Большое количество других белков также ассоциируют с теломерами человека и вносятважный вклад в защитную функцию шелтерина (например, Ku70/80). Однако, как правило этифакторы присутствуют в гораздо меньшем количестве, чем белки шелтеринового комплекса, аих ассоциация с теломерами часто временная (шелтерин находится на теломерах в течениивсего клеточного цикла). Поэтому обычно эти белки рассматривают, как медиаторы функцийшелтерина [134].2.3.2.
Теломераза человекаТеломеразный комплекс человека сильно отличается от дрожжевых по составу исвойствам. Теломеразная РНК человека (hTR) короче дрожжевых более чем в два раза и у неёотсутствуют такие характерные для дрожжевых TR элементы, как сайт взаимодействия с Smбелками и участок взаимодействия с белком Est1 [112]. Более того, у человека есть тригомолога Est1: Est1A/Smg6, Est1B/Smg5 и Est1C/Smg7, но ни один из них не выполняетфункции привлечения теломеразы на теломеры.
Est1A и Est1B ассоциированы с активнойтеломеразой, однако его функция до сих пор неизвестна [135, 136]. Важно отметить, что одиниз доменов белка шелтеринового комплекса TPP1 гомологичен субъединице теломеразыS. cerevisiae белку Est3 [137]. Как Est3, так и TPP1 взаимодействуют с N-концевым доменовтеломеразной обратной транскриптазы TERT и стимулируют теломеразную активность [138].На 3' конце hTR содержит мотивы H/ACA, присутствующие в некоторых мяоРНК.Аналогично другим мяоРНК hTR связывает дискерин, GAR1, NOP10 и NHP2 и эти белкиобеспечивают стабильность 3'-конца hTR [112].
hTR также содержит особый CAB мотив,служащий местом связывания ещё одного компонента теломеразного комплекса человека –белка TCAB1 [139]. TCAB1 важен для локализации теломеразы в тельца Кахаля, а также дляпривлечения на теломеры.2.3.3. Регуляция теломеразы на теломерахЭксперименты на клеточных линиях позволили установить, что аналогично другиммодельным организмам теломерные белки человека задействованы в ингибировании удлинения33теломертеломеразой.НокдаунTRF1приводиткудлинениютеломер,тогдакаксуперэкспрессия TRF1 укорачивает теломеры [140, 141].
Длинные теломеры содержат большеTRF1, чем короткие [142], а специфическое привлечение TRF1 на одну из теломер приводит кеё укорочению[143]. TRF2 и Rap1 также являются негативными регуляторами длины теломер,однако, их влияние на теломеры несколько отличается от TRF1 [141, 144, 145]. Так, например,если механизм действия TRF1 заключается в ингибировании действия теломеразы, то TRF2укорачивает теломеру по другому механизму (не зависящему от теломеразы) [143]. Остальныекомпоненты шелтерина TIN2, TPP1 и POT1 ведут себя подобно TRF1 [142, 146, 147, 148].Шелтерин может быть выделен из клеточных экстрактов в свободной от ДНК форме[149, 150].