Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 8

Отдельно стоит отметить Y. lipolytica: теломеры этого вида почкующихсядрожжей связаны белком Tay1 (гомологом TRF белков), и в геноме Y. lipolytica нет гомологовRap1 и Cdc13. Возможно, дальнейшие эксперименты покажут, что теломеры Y. lipolytica построению и свойствам более похожи на теломеры делящихся дрожжей и млекопитающих.Определение общих функций теломерных белков различных организмов позволитвыявить более консервативные (следовательно, более значимые) аспекты механизмовподдержания длины теломер. Поэтому использование различных модельных организмов визучениителомеразы и теломерявляется важной и актуальной задачей. Простейшиеорганизмы, такие как почкующиеся дрожжи, по-прежнему остаются подходящими кандидатамидляэтойцели,ввиду простотыкультивированияипроведениягенно-инженерныхманипуляций.383.

Результаты и обсуждение3.1. Постановка задачиВ предыдущем разделе мы подчеркнули важность использования разнообразныхмодельных организмов для изучения теломер и теломеразы. Одним из таких организмовявляются дрожжи Hansenula polymorpha. H. polymorpha – термотолерантные метилотрофныепочкующиеся дрожжи. Помимо основных преимуществ работы с простейшими эукариотами(простота культивирования и проведения генно-инженерных манипуляций), полезнымсвойством H. polymorpha является термофильность: некоторые штаммы дрожжей этого видаспособны выживать при температурах выше 50 оС.

Белки и нуклеопротеиновые комплексытермотолерантых организмов являются более стабильными, что облегчает работу с ними invitro. Особенно актуальным этот факт является для теломеразы, поскольку в клетке этотфермент присутствует в крайне малых количествах, и его выделение для структурных ибиохимических исследований затруднено.H.

polymorpha включают в себя несколько штаммов дрожжей, которые на самом делепредставляютсобойразличныевиды[11].Проводилосьнесколькопопытокпереклассифицировать некоторые из них. В данной работе используется штамм H. polymorphaDL-1 (ATCC 26012). Согласно последней классификации его отнесли к виду Candidaparapolymorpha [165], однако большинство исследователей по-прежнему придерживаетсяисторического названия Hansenula polymorpha DL-1 (встречается ещё название Ogataeaparapolymorpha DL-1 [11]).

В данной работе мы будем использовать название H. polymorpha.На сегодняшний день опубликован как митохондриальный, так и ядерный геномH. polymorpha [11, 166]. Согласно полученным данным филогенетически ближайшими кH. polymorpha видами являются Brettanomyces custersianus и Dekkera bruxellensis. ЭволюционноH. polymorpha значительно удалены от остальных дрожжей, используемых для изучениятеломер (Рисунок 3.1). На концах хромосом H.

polymorpha содержится последовательность 5’GGGTGGCG-3’, повторяющаяся 18-23 раз, что делает H. polymorpha обладателем самыхкороткихтеломерсредивсехорганизмов.Теломерыэтоговидадрожжейтакжехарактеризуются высокой гомогенностью [167]. Таким образом, H. polymorpha являетсяполезным и интересным модельным организмом для изучения теломеразы.39Рисунок 3.1. Схема эволюционного положения H. polymorpha относительно модельныхпочкующихся дрожжей, описанных в данной работе (упрощённая адаптация из [11]). CTG –вид, у которого CTG кодон соответствует серину, а не лейцину; WGD – вид, у которогопроизошла дупликация генома.В нашей лаборатории были определены и охарактеризованы основные компонентытеломеразного комплекса H.

polymorpha: теломеразная РНК (HpTER), HpTERT, HpEst1 иHpEst3 [168, 169, 170, 171]. HpTER содержит основные элементы, характерные для TLC1 идругих теломеразных РНК почкующихся дрожжей, тем не менее, были обнаружены некоторыеособенности. Одной из них является особое свойство матричного участка HpTER. Наосновании комплементарности теломерному повтору матричный участок HpTER долженпредставлять собой последовательность из 17 нуклеотидов (комплементарную двум повторамGGGTGGCG + ещё один нуклеотид – С187, Рисунок 3.2). Однако, характеризациятеломеразной активности in vitro выявила использование для обратной транскрипциидополнительного нуклеотида – А170 [169].

Так, к олигонуклеотиду 5’-(GGGTGGCG)4-3’ вместоодного повтора 5’-GGGTGGCG-3’ теломераза добавляет последовательность 5’-GGGTGGCGT3’ (Рисунок 3.2). Следовательно, вместо предсказанных 17 нуклеотидов, матричный участокHpTER содержит 18.40Рисунок 3.2. Схема удлинения олигонуклеотида G4 теломеразой H. polymorpha in vitro.Однако, среди последовательностей теломер, полученных в результате секвенированиягеномаH.

polymorpha[11],небылообнаруженониединогослучаяприсутствиядополнительного нуклеотида dT после последовательности 5’-GGGTGGCG-3’. Следовательно,обратная транскрипция А170 может быть in vitro артефактом. С другой стороныпоследовательность 5’-GGGTGGCGT-3’ не является субстратом теломеразы, поскольку неможет отжигаться в матричном участке [169].

Значит, дополнительный dT может удаляться дляработы теломеразы, что должно затруднять его детекцию in vivo. Тогда включениедополнительного «нетеломерного» dT может служить механизмом для регулирования работытеломеразы. Изучение этой возможности станет первой задачей данной работы.Другой задачей станет дальнейшая характеризация регуляции длины теломерH. polymorpha.Упочкующихсядрожжейрегуляциятеломеразыосуществляетсяпреимущественно теломерными белками. Поэтому было решено проанализировать функциибелков H. polymorpha, гомологичных известным регуляторам длины теломер другихпочкующихся дрожжей.Таким образом, целью настоящей работы является изучение регуляции длины теломерH.

polymorpha.413.2. Обратная транскрипция А1703.2.1. Детекция дополнительного dT на теломерах in vivoНевозможность использования теломеразой последовательности 5’-GGGTGGCGT-3’ invitro и необходимость удаления дополнительного dT для работы теломеразы означает, чтоединственным местом в теломере где dT может находиться (если транскрипция А170происходит) – самый 3’-конец теломеры. Анализируемые ранее последовательности теломер,полученные в результате секвенирования генома H. polymorpha, могли не содержать концевыхтеломерных повторов, и поэтому включение dT не наблюдали ранее.Для того, чтобы получить последовательности теломер H.

polymorpha вместе сконцевыми повторами было решено применить следующий подход. Первый этап – получениефрагментов, содержащих теломерные последовательности H. polymorpha, при помощи«теломерного»ПЦР,второй–высокопроизводительноесеквенированиеполученныхфрагментов. «Теломерный» ПЦР проводили по методике, успешно применяемой ранее дляполученияпоследовательностейтеломервдругихорганизмах[172],снебольшоймодификацией (Рисунок 3.3).Рисунок 3.3. Схема эксперимента для определения последовательностей теломерныхповторов H. polymorpha.42К геномной ДНК H.

polymorpha лигировали заранее сформированный короткийдвуцепочечныйфрагментДНКс3’-выступающейодноцепочечнойслучайнойпоследовательностью («адаптер»). Выступающий конец «адаптера» нужен, поскольку теломерытакже имеют 3’-выступающий конец; а случайная последовательность позволяет «адаптеру»присоединяться ко всем теломерам независимо от точной последовательности последнеготеломерногоповтора.ДалеепроводилиПЦРсиспользованиемолигонуклеотида,комплементарного субтеломерной области, и другого олигонуклеотида, комплементарногопоследовательности адаптера, в качестве прямого и обратного праймеров, соответственно.

Врезультате получали ДНК фрагмент длиной около 200 пн, содержащий теломерные повторыH. polymorpha (рис 3.3).Последовательности теломерных повторов в полученных ДНК фрагментах определялипри помощи высокопроизводительного секвенирования (по методу Roche/454 Life Sciences).СеквенированиепроводиливлабораторииНиколаяВикторовичаРавина(Центр«Биоинженерия» РАН). В результате было получено 5317 последовательностей (ридов).

Ридыполучались в результате прочтения ДНК как с прямого праймера (тогда рид представляет собойG-цепь теломеры), так и с обратного (С-цепь теломеры). Большинство ридов представлялисобойпродуктынеполногопрочтенияДНКфрагментов,однако,встречалисьи«полноразмерные» риды. Пример такого «полноразмерного» рида представлен на рисунке 3.4.На данном примере хорошо видно, что внутренние теломерные повторы представленыпоследовательностью 5’-GGGTGGCG-3’ (либо допустимыми вариантами, с пропусками G вуказанных позициях: 5’-GGGTGGCG-3’), и только самый последний повтор (непосредственноперед адаптером) имеет dT нуклеотид в нужном положении 5’-GGGTGGCGT-3’.>H9J94MM01DGYI7 length=181 xy=1306_0833 region=1 run=R_2013_05_16_16_15_48_AAGCGCAGAGTTGGTTTCAGGATGCGGTCTGAGGCTCTGGTGGCGGGTGCGGGTGGCGGGTGGTGGCGGGTGGCGGGTGGCGGGTGGCGGTGGTGCGGGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCGGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCGTATCTACAGTGAGTCGTACGCРисунок 3.4.

Пример «полноразмерного» рида ПЦР фрагмента,содержащеготеломерную ДНК H. polymorpha. Серым цветом выделена субтеломерная часть, чёрным –адаптерная последовательность. Последний теломерный повтор подчёркнут. ДополнительныйdT нуклеотид выделен красным цветом.43Таким образом, дополнительный dT нуклеотид действительно встречается в теломерахH.

polymorpha в составе последнего теломерного повтора. Мы решили проанализироватьчастоту встречаемости dT среди полученных в данном эксперименте ридов. Посколькубольшинство ридов были продуктами неполного прочтения ДНК фрагментов, и средивнутренних теломерных повторов дополнительный dT не находится, то мы проанализировалитолько риды, содержащие крайние повторы (таких ридов оказалось 1248). Для этого мыпосчитали число ридов с каждым из возможных вариантов последовательности последнегоповтора (таблица 3.1). Для наглядности результаты данного анализа также представлены нарисунке 3.5.Таблица 3.1. Анализ концевых теломерных повторов. Число последовательностей каждогоиз вариантов повтора отражается числом ридов, содержащих NNNNNNNNAT (для ридов,прочитанных с прямого праймера) + ATNNNNNNNN (для ридов, прочитанных с обратного праймера),где NNNNNNNN – последовательность теломерного повтора, AT – последовательность от адаптера(маркирующая в данном случае концевой теломерный повтор).Последовательностьпоследнего Число последовательностей% от суммарноготеломерного повтораGGGTGGCGTAT+ATACGCCACCCколичества112189,82GGGTGGCGAT+ATCGCCACCC443,53GGGGTGGCAT+ATGCCACCCC312,48CGGGGTGGAT+ATCCACCCCG10,08GCGGGGTGAT+ATCACCCCGC10,08GGCGGGGTAT+ATACCCCGCC151,20TGGCGGGGAT+ATCCCCGCCA50,40GTGGCGGGAT+ATCCCGCCAC110,88GGTGGCGGAT+ATCCGCCACC191,521248100Суммарное количество44Рисунок 3.5.