Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М. В. ЛОМОНОСОВА__________________________________________________________Химический факультетКафедра химии природных соединенийНа правах рукописиМАЛЯВКО АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧРЕГУЛЯЦИЯ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР ДРОЖЖЕЙHansenula polymorphaСпециальность 02.00.10 – биоорганическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:д. х. н., профессор,член-корр. РАН Донцова О.А.к. х. н., доцент Зверева М.Э.Москва – 2014ОглавлениеОглавление ............................................................................................................................................... 2Список сокращений ................................................................................................................................ 41.

Введение ............................................................................................................................................... 52. Обзор литературы. Регуляция длины теломер ................................................................................. 62.1. Регуляция длины теломер почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica) ...............................................................................

82.1.1. Строение теломер ....................................................................................................................... 92.1.2. Теломераза почкующихся дрожжей ........................................................................................ 122.1.3. Регуляция длины теломер Saccharomyces cerevisiae...............................................................

132.1.4. Регуляция длины теломер других почкующихся дрожжей ................................................... 212.2. Регуляция длины теломер делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe) ....................... 252.2.1. Строение теломер ..................................................................................................................... 252.2.2. Теломераза S.

pombe................................................................................................................... 262.2.3. Регуляция длины теломер S. pombe .......................................................................................... 262.3. Регуляция длины теломер человека (Homo sapiens) ................................................................... 322.3.1. Строение теломер человека .....................................................................................................

322.3.2. Теломераза человека .................................................................................................................. 332.3.3. Регуляция теломеразы на теломерах ...................................................................................... 332.4. Заключение ..................................................................................................................................... 373. Результаты и обсуждение ................................................................................................................. 393.1. Постановка задачи ..........................................................................................................................

393.2. Обратная транскрипция А170 ....................................................................................................... 423.2.1. Детекция дополнительного dT на теломерах in vivo ............................................................. 423.2.2. Влияние мутаций нуклеотида А170 HpTER на длину теломер ............................................. 463.2.3. Обратная транскрипция А170, как способ контроля длины теломер................................. 523.3.

Регуляция длины теломер H. polymorpha. Теломерные белки .................................................. 553.4. Заключение ..................................................................................................................................... 6524. Материалы и методы......................................................................................................................... 664.1.

Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы ...... 664.2. Методики, использованные в работе ........................................................................................... 714.2.1. Базовые методики работы с ДНК и клетками, клонирование ............................................. 714.2.2. Определение последовательностей теломер H. polymorpha ................................................ 764.2.3. Получение штаммов, экспрессирующих мутантные формы HpTER .................................. 774.2.4. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов ............................................. 784.2.5. Получение штаммов Rap1A-ΔC-HA и Rap1B-HA ....................................................................

804.2.6. Получение «нокаутных» штаммов .......................................................................................... 824.2.7. Иммунопреципитация хроматина ........................................................................................... 835. Выводы ............................................................................................................................................... 866.

Список литературы ........................................................................................................................... 873Список сокращенийДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаРНК – рибонуклеиновая кислотаTR – теломеразная РНКTERT – теломеразная обратная транскриптазаRPA – Replication Protein AChIP – иммунопреципитация хроматинаоцДНК – одноцепочечная ДНКдцДНК – двуцепочечная ДНКTRD – быстрое удаление теломерымяоРНК – малая ядрышковая РНКПЦР – полимеразная цепная реакциянт – нуклеотидпн – пара нуклеотидовтпн – тысяча пар нуклеотидовНА – гемагглютининНА-таг – гемагглютининовый тагНА-агароза – агароза, ковалентно модифицированная антителами к гемагглютининуWT – дикий типTris – трис(гидроксиметил)аминометанЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрияДСН – додецилсульфат натрияДТТ – 1,4-дитио-DL-треитолПМСФ – фенилметилсульфонилфторидБСА – бычий сывороточный альбуминdNTP – дезоксинуклеотидтрифосфатыДМСО – диметилсульфоксидPEG4000 – полиэтиленгликоль 4000ScRap1 – Rap1 из Saccharomyces cerevisiae.

Аналогично для других белков и другихвидов дрожжей, например, KlRif1 – Rif1 из Kluyveromyces lactis. mRap1 – Rap1 мыши, hRap1 –Rap1 человека. Аналогично для других белков мыши и человека.41. ВведениеКонцы эукариотических хромосом (теломеры) имеют структуру отличную отвнутренних участков хромосом.

Особое строение теломер позволяет им выполнять важнейшиефункции. Например, теломеры осуществляют защиту хромосом от слияния и деградации, чтонеобходимо для поддержания стабильности генома и жизнеспособности клеток. Однако, врезультате недорепликации при каждом клеточном делении хромосомы соматических клетокэукариот теряют теломерную ДНК, и по достижении теломерами критической длины клеткивходят в особое состояние (сенессенс) и, в конечном счёте, гибнут.Теломераза – ферментативный комплекс, способный синтезировать теломерную ДНК,поддерживая длину теломер на нормальном уровне.

Неограниченный пролиферативныйпотенциал одноклеточных эукариот, половых и стволовых клеток поддерживается за счёттеломеразы. Примечательно, что большинство типов раковых клеток также активируеттеломеразу, и это придаёт им возможность делиться бесконечно. Поэтому теломераза являетсяпривлекательной мишенью для противоопухолевой терапии [1, 2].Стабильность генома обеспечивается контролем длины теломер, что включает в себярегуляцию различных и иногда противоположных по действию ферментов: нуклеаз,репликативных полимераз и теломеразы. Тем не менее, многие аспекты регуляции длинытеломер до сих пор остаются невыясненными.За последние десятилетия было изучено множество факторов, отвечающих за контрольдлины теломер одноклеточных организмов, в частности – дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3].Однако, детали функционирования теломерных белков и теломеразы человека сильноотличаются от таковых в S. cerevisiae [4]. Сравнительный анализ может выявитьконсервативные и видоспецифические аспекты регуляции длины теломер, поэтому изучениедругих видов почкующихся дрожжей является актуальной задачей.Данная работа посвящена изучению регуляции длины теломер дрожжей Hansenulapolymorpha.

Этот модельный организм, сохраняя преимущества работы с простейшимиэукариотами,обладаетрядомособыхинтересныхсвойств.H.polymorphaявляетсятермотолерантным организмом, что должно облегчать in vitro работу с его молекулярнымикомпонентами. Также H. polymorpha отличается от S. cerevisiae особенно короткимителомерами и гомогенностью теломерных повторов, что делает изучение регуляции длинытеломер дрожжей H. polymorpha интересной и актуальной задачей.52.

Обзор литературы. Регуляция длины теломерКонцы хромосом, по сути, представляют собой двуцепочечные разрывы в геноме.Репарация разрывов ДНК является необходимой для сохранения генетической информации.Для этого клетки используют сложные механизмы с участием огромного количества белков.Однако, узнавание теломер как разрывов такими белками привела бы к слипанию хромосом,что в свою очередь привело бы к катастрофическим последствиям. Поэтому защита концовхромосом от систем репарации двуцепочечных разрывов является, пожалуй, основнойфункцией теломер. Защитные функции теломер реализуются благодаря особому их строению.Теломерная ДНК состоит из повторяющихся коротких G/С-богатых последовательностей.Различают двуцепочечную часть теломер и одноцепочечную (3'-выступающий конец). Скаждой из этих частей связывается специфический набор белков.