Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 10
Описание файла
PDF-файл из архива "Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 10 страницы из PDF
ТеломеразаH. polymorpha также непроцессивна in vitro. Однако, по аналогии с S. cerevisiae можнопредположитьсуществованиеопределённыхусловий,когданеобходимаактивацияпроцессивности теломеразы. Дополнительный dT нуклеотид в таком случае представляет собойидеальный переключатель из непроцессивного в процессивное состояние (и наоборот). Тогдацикл работы теломеразы H. polymorpha будет выглядеть, как изображено на рисунке 3.10.После связывания теломеры и синтеза теломерного повтора может произойти либо добавлениеdT и диссоциация теломеразы, либо транслокация и синтез следующего повтора.В то же время, если теломераза H.
polymorpha непроцессивна при любых условиях,обратная транскрипция А170 всё равно может регулировать количество добавленныхтеломерных повторов. Ведь встраивание дополнительного нуклеотида должно нарушатьвозможность синтеза следующего теломерного повтора и другой молекулой теломеразы. Так, вкаждой S-фазе клеточного цикла несколько молекул теломеразы S. cerevisiae синтезируюттеломерную ДНК на одной теломере [55]. Если такая ситуация осуществляется и вH.
polymorpha, то регуляция посредством обратной транскрипции А170 может выглядеть как нарисунке 3.11. В этом случае теломераза всегда диссоциирует после добавления одного повтора,независимо от добавления dT. Удлинение теломеры будет происходить до тех пор, пока одна изтеломераз не добавит dT .Другим сценариемрегуляциипосредством обратнойтранскрипцииА170 принепроцессивной теломеразе может быть следующее. Цикл работы будет выглядеть так же, как52на рисунке 3.11. Однако, предположим, что только одна молекула теломеразы может сработатьв S-фазе на одной теломере.
Тогда вероятность обратной транскрипции А170 будетпроявляться, как доля теломер, содержащих dT на конце хромосом; а этот параметр прямовлияет на число теломер, способных удлиниться теломеразой.Рисунок 3.10. Цикл работы теломеразы H. polymorpha. Регуляция процессивности типаII.53Рисунок 3.11. Цикл работы теломеразы H. polymorpha. Регуляция процессов последиссоциации.К сожалению, введённые нами мутации матричного участка HpTER не позволяютразличить эти возможные сценарии. Более того, нарушение регуляции теломеразы за счётмутаций А170С и С178А могут приводить к удлинению теломер посредством нарушения ещёодного аспекта теломеразной активности in vivo.
Во всех изученных организмах теломеразасинтезирует нуклеотиды только в поздней S-фазе клеточного цикла. В S. cerevisiae, эторегулируется, по меньшей мере, белками Rif: в отсутствие Rif1 и Rif2 теломераза можетдействовать и в других фазах [55]. В H. polymorpha ограничение активности теломеразы вне Sфазы клеточного цикла может происходить из-за присутствия дополнительного dT нуклеотида.В любом случае, открытое нами свойство теломеразы H.
polymorpha является важнымфактором ограничения длины теломер в этом организме. В обзоре литературы былирассмотрены различные способы контроля длины теломер в других организмах, в частности впочкующихся дрожжах S. cerevisiae. Возникает вопрос: действуют ли в H. polymorphaмеханизмы регуляции длины теломер описанные для S. cerevisiae? В следующем разделе мыпопытаемся дать ответ на этот вопрос.543.3. Регуляция длины теломер H. polymorpha. Теломерные белкиОсновной механизм регуляции длины теломер S.
cerevisiae осуществляется белкамиRap1, Rif1, Rif2, комплексом MRX и киназой Tel1. Мутация в гене RAP1 (приводящая к потереС-концевого домена), равно как и удаление генов RIF1 и RIF2, приводит к значительномуудлинению теломер S. cerevisiae. С другой стороны, результатом удаления гена TEL1, либо генаодного из компонентов комплекса MRX, является укорочение теломер. Для ответа на вопрос оконсервативности механизмов поддержания длины теломер H.
polymorpha и S. cerevisiae мырешили проверить влияние удаления соответствующих генов H. polymorpha на длину теломер.В качестве компонента комплекса MRX был выбран белок Mre11.Идентификация гомологов указанных белков в геноме H. polymorpha осуществляласьпри помощи программы BLAST со стандартными параметрами. Поиск осуществлялся по базеданных NCBI, содержащей последовательности предсказанных белков H.
polymorpha, сиспользованием последовательностей соответствующих белков S. cerevisiae в качествепоискового запроса. Основным критерием отбора служило значение оценки выравнивания(alignment score): предсказанный белок H. polymorpha считался гомологом соответствующегобелка S. cerevisiae в том случае, когда значение оценки выравнивания двух белков превышало40.В результате для четырёх белков S. cerevisiae были найдены гомологи в H.
polymorpha(таблица 3.2). Исключением оказался белок Rif2: его гомолог не был обнаружен в H.polymorpha. Это не удивительно, поскольку во многих других видах почкующихся дрожжейтакже не могли обнаружить гомолога Rif2 [10].Таблица 3.2. Гомологи H. polymorpha белков-регуляторов длины теломер.55Поиск BLAST выдал два кандидата в гомологи белка Rap1, удовлетворяющих критериямотбора: Rap1A (ESW96538.1) и Rap1B (ESW98690.1). Наличие двух гомологов говорит овозможном разделении функций Rap1 в H. polymorpha. Дупликация теломерных белков –довольно распространённое явление: в некоторых видах дрожжей рода Candida присутствуетдва гомолога Cdc13, в клетках мыши – два гомолога POT1 [39, 178]. Тем не менее, нельзяисключить вероятности того, что один из обнаруженных нами Rap1 белков H.
polymorphaпотерял теломерную функцию в ходе эволюции.Чтобы получить предварительные данные о возможных функциональных отличияхScRap1 и его гомологов в H. polymorpha, мы решили проанализировать доменную структуруHpRap1AиHpRap1B.ScRap1состоитизтрёхфункциональныхдоменов:BRCT,дуплицированный MYB домен и С-концевой домен. В гомологе Rap1 человека, например,MYB домен не дуплицирован и с этим связывают его неспособность связывать теломернуюДНК напрямую. У гомолога Rap1 C. albicans отсутствует С-концевой домен, играющийключевую роль в регуляции длины теломер.
Наличие подобных отличий между ScRap1 иHpRap1A и HpRap1B позволило бы сделать предположения о функциях последних. Мыпостроили множественное выравнивание белковых последовательностей гомологов Rap1 изнекоторых видов почкующихся дрожжей (Рисунок 3.12). Данное выравнивание показалоприсутствие в HpRap1A и HpRap1B консервативных мотивов, характерных для всех трёхдоменов ScRap1, несмотря на низкую общую консервативность (характерную для теломерныхбелков). Проведённый анализ свидетельствует о схожей доменной организации Rap1 белков H.polymorpha и S.
cerevisiae, следовательно, о возможности выполнения этими белкамианалогичных функций.56А. BRCT доменSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB10698147242284817114EPTTDDTAADEKKEQVS------GPPLSNMKFYLNRDADAHDSLNDIDQLARLIRANGGEVLDSKPRESK--E---NVFINETSTSTGENPQKDQNA-TPVAISTLFQGMNFFMNRNNDAHDSAHDVDQLARLIMAHSGNVLASLPEDTTDVS---NVYVAPLRTN---SNTSDNGA-NPVKKKLVFENIKFFINRDSGAIDSSTEADQLERLITANGGEIVKALPQQAS--S---DFFV------------------------GIFHGLKFYFADDIN-------KDYYKSAVSKLGGVVLEEPPKEVQ--R---DQYI-----------------------VGVFDGVSFFIDPLI------NDMEALGNAVRNNGGAVLIEAPEKSS--REWEAAYF-----------PKNSPP-KPIFVDKDGKSMLFYIPEDEPN------RNKYRDLIIRYGGVIVEKGFPTV----------I-----------PNRSPP-KPIFIDKDGKSMYFYIPEDEPN------RNKYRDLIITHGGVLVEKYFPSI----------I--------------------SPLDQVLLGQKFILLGNGAA------NEDVSHVIEELGGSVVSGENNQGI--Y---LARS------------GAGPAQSDVFIDATGKPMKFYLYPPLDR------NQQLINLIENNGGHVVAGVSKDTVILS---SEEFSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB175174218687113613312073V-SPYN-HTNLPTVTPTYIKACCQSNSLLNMENYLVPYDNF-REVVDSR-LQEESHSNGVDNS-NS--------N--SDNI-SPYN-DTKLPTVTPTYIKACVSNNTLLNINHYLVPYDEF-RSVIDTQ-LQSETNNDDD-HV-DH--------DEASKKV-SPYN-DTKLPTITTTYIRTCIARDTLLPLENYLVPYDEF-RAVIDSE-LRSLNGDGE--KA-DQ--------N--DHIV-SHVN-TFDLPTVDPLFISNSLDQNTLLNVGPFLLPPVNE-RSEYDVD-VSDTSRIDS-------------------RIVSKRYD-EDYRIFVHPSYILDCIDAGTLLNVHDYLGKPESSGFVRFDSNSISDEYNIGS--QLSDLPGSDVTRAA--VKIL-LSNN-EDLYGFSKLKFIDDCIAKNQLLSVFDYGT-YGTY-NNPEDAA-FDTTSIINEL-N---D------------DLP-LSNN-EELIGFIKLTFIDDCIAQNQLLPVIDYGT-YG----NPEDAP-FDASSIIDEF-H---S------------DLV-SDVNPNINVPVYSFNFVYTAQRDHVLPDLNDFKIR-RPP-Q------------------------------------LL-MSED-LKRFHVYRYEFVQKSITHG-IQNLSDYEIH-------------------------------------------Б.
MYB1+MYB2 доменSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB372354393235225264252209138LDVVRKNPTRR-TTHTLYDEISHY--V----PNHTGNSIRHRFRVYLSKRLEYVYEVDKF-GKLVRDDDGN-LIKT--KVLDVVRKNPTRR-TTHTLYDEISHY--V----PNHTGNSIRHRFRVYLSKRLDYVYQVDSY-GKLVRDENGN-LIKT--KTLDVVRKNPTRR-TTHTLYDEISHY--V----PNHTGNSIRHRFRVYLSKRLDFVYEVDKY-GKLVRDEDGN-LIKT--KLLDVVRKNPTRR-TTHTLFDEISHY--V----PNHTGNSIRHRYRVYLSKRLNYVYKVDEN-GKLLRDEKGE-FIKT--DVLDVVRKNPTKR-TTHTLYDEISHY--V----PNHTGNSIRHRFRVYLSKRLEFVYQVDED-GKLVRDQDGN-LIKT--DILEHIRRKPRFR-QSQKFYAQLALL--E--PLRGHTGNSIRSRFRKHLESRLNYIYKTDDQ-DQLIRDEAGN-LIKIGLDELEQVRRKPRFR-QSQKFYRKLAEL--E--PLRGHTGNSIRSRFRKHLESRLNYIYKTNDM-DELIYDEAGN-LIKIGLDQLDLIRRNPNLR-STHSFFAKIAQLPVL----SGHTGNSIRFRFRKILADKLDYVYQVDPQTNKLILDPVTNEPIKV--KDFEEIRKRPWMGYKGHQIYKDIAEL--DFFKERNRSAASLRERIRT-LKYDIEYVYKAGPN-KELLRDANGN-YIRD--YDSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB441423462304294337325282211LPPSIKRKFSADEDYTLAIAVKKQFYRDLFQIDPDTGRSLITDEDTPTAIARRNMTMDPNHVPGSEPNFAAYRTQSRRGPLPPSIKKKFTADEDYILALAVKKQFYRDLYQIDPDTGTNLISNEDSPTAIARRNMTMDPNHVPGNEPSFNDFRVNDRRGPLPPSIKKKFTADEDYALAVSVKKQFYRDLYQIDPDSGQSLISAQDSPTAIARRNMTMDPNHIPGSEPGFKEYKVNDRKGPLPQGLKRKFTADEDYQLALNIKKQFYKDIYQVDPDTGESLIRDDDEPSTVAKRKMVMDPTFIPGKEPSFQDYNVGDRRGPLPNGLKRKFTSEEDYNLAVAVKKQFYRDAFQRDPDTGASLIAEDDEPNIVAKRQLVMNTEIDPSEVPSFEKYTVNDRRGPMPGTLKNKFTPEDDYLLCCVALEYMAS----------------------------------------------NNIDSIGMPGTLKNKFIPQDDYILCCYALKYMET----------------------------------------------TNTDSSALPSLLKSQYTAEEDYELCKHILH-FKEN------------------MSQYAKK-RKLDGNS------------------IKK-KTTNFSAWEDFEMCRTIYMKLR----PTTDEKGFEII--------------------------------------NSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB521503542384374371359323248IAREFFKHFAEEHAAHTENAWRDRFRKFLLA-YGIDDYISYYEAEKAQNREPEPMKNLTNR-------PKRPGVP----VAREFFKSFADANVSHSENAWRDRFRKFLLT-FGVDHYIEYFEQETNAGRKPEPMKNLTNR-------PRRKAGI----IAREFFKSFADENPTHTENAWRDRYRKFLLT-FGVDAYIAYYEIERASGREPKPMKNLTNR-------PKRVNAP----LSREFFKTYGEKYPSHTENAWRDRFRKFLLN-YGIDEYIAYYENEQAHNRVPEPMKNMTNR-------VKRPG-P----LSREFFKLFALEVPTHSENAWRDRFRKFILP-YGIDSYISYYEKCMEEGIEPESIKNMTNR-------PKREG-P----LRYSFFDGMYRKYRNHTLQSWRDRFRKYIRDKSDLVDYKEYYENCEKVGMAPRCLTRIAP-------------------LPYSFYDSMYRKCPKHTLHSWRDRFRKFIRDKTDLVEYKEYYENCEKVGMTPRCLTRIAP-------------------IPESVFTELVAKFPRHSAMSWRDRYRKFASK-YGLEEYMKYYEDCLAKNITPQPMKNLSSR-------AKDSKDVKRMKLFPTGFFDNYASSHPRHTSESWRQRYKNFLSL-FGIANYLKYCIMQIRQDKEPQPANSANKDWLNARKHLKRA--S-----57В.