Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 2

Последовательностителомерных повторов и теломерных белков различных организмов могут сильно отличаться [5].В норме соматические клетки теряют теломерную ДНК при каждом раунде репликации. Этосвязано с удалением короткой РНК затравки, необходимой для синтеза отстающей цепи ДНКполимеразой,чтоприводиткнеполнойрепликациителомернойДНК(проблеманедорепликации). В результате, после определённого числа делений длина теломер становитсяслишком короткой для выполнения защитной функции. Это, в конечном счете, ведёт к гибеликлеток [6].Теломераза – фермент, предназначенный для решения проблемы недорепликации.Основными компонентами теломеразного комплекса являются теломеразная РНК (TR) ителомеразная обратная транскриптаза (TERT).

Помимо основных компонентов (TR и TERT) всостав теломеразного комплекса входит ряд вспомогательных белков, регулирующих этапыработы теломеразы. Точный состав комплекса варьирует у различных организмов [7].Теломеразная РНК содержит короткий участок комплементарный полутора или двумтеломерным повторам (матричный участок), который использует TERT для синтеза теломернойДНК [8].

Выделяют четыре этапа работы теломеразы (Рисунок 2.1). На первом этапепроисходит связывание ДНК-субстрата (3'-конец теломеры). Второй этап (элонгация) – синтезтеломерного повтора. Характеристикой работы теломеразы на этом этапе являетсяпроцессивность I-го типа – количество нуклеотидов теломерного повтора, добавленных бездиссоциации фермента.

После синтеза одного повтора теломераза может переместитьтеломерную ДНК в начало матричного участка (транслокация – третий этап) и сновасинтезировать повтор. Количество теломерных повторов, добавленных за один раунд работытеломеразы – процессивность типа II. На четвёртом этапе происходит диссоциация теломеразыи теломеры.6Рисунок 2.1. Схема работы теломеразы. Используется последовательность теломерногоповтора человека.Теломеры с одной стороны должны обеспечивать защитную функцию: закрывать доступк ДНК нуклеазам и белкам систем репарации, а с другой стороны – обеспечивать доступтеломеразе для синтеза теломерной ДНК при каждом клеточном делении.

Более того,теломераза должна удлинять все теломеры равномерно: ведь даже одной короткой теломерыдостаточно для остановки клеточного цикла и потере хромосомы [9]. Для этого восстановлениетеломерной ДНК на коротких теломерах должно происходить более интенсивно, чем нателомерах нормальной длины. Механизмы, обеспечивающие поддержание этого баланса, истанут предметом данного обзора литературы. Ввиду больших отличий систем поддержаниястабильности теломер различных групп организмов, они будут рассмотрены отдельно, что иопределит структуру данного обзора.

В каждой главе будут кратко описаны строение теломер ителомеразного комплекса, а затем – регуляция длины теломер.72.1. Регуляция длины теломер почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae,Candida albicans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica)По ходу эволюции дрожжей произошло, по меньшей мере, два необычных события:возникновение видов, использующих CTG кодон для кодирования серина (а не лейцина, какостальные), а также дупликация генома (WGD, whole-genome duplication).

В качествемодельных организмов для изучения теломер и теломеразы используется, по крайней мере, поодному виду дрожжей, представляющих каждое из этих событий, а также некоторыепромежуточные виды [10]. Относительное эволюционное родство модельных почкующихсядрожжей, описанных в данном обзоре, схематически изображено на рисунке 2.2. Наиболееизученными являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, поэтому им будет уделено основноевнимание.Рисунок 2.2. Схема эволюционного родства почкующихся дрожжей, описанных вданном обзоре (упрощённая адаптация из [11]).

CTG – вид, у которого CTG кодонсоответствует серину, а не лейцину; WGD – вид, у которого произошла дупликация генома.82.1.1. Строение теломерТеломеры почкующихся дрожжей претерпели очень сильные изменения за времяэволюции: последовательности теломерных повторов значительно отличаются у разных видов(и отличаются от канонической TTAGGG последовательности), длина повтора находится впределе 8-25 пн, при этом теломерные повторы часто являются гетерогенными [12]. Например,теломерный повтор S. cerevisiae гетерогенный T(G)2-3(TG)1-6, в то время как теломерыC.

albicans состоят из гомогенных повторов ACGGATGTCTAACTTCTTGGTGT.С двуцепочечным участком теломер S. cerevisiae связан белок Rap1, посредством MYBдомена [13]. С С-концевым доменом Rap1 взаимодействует два набора белков. Один из этихнаборов (Sir3 и Sir4) ответственен за формирование гетерохроматина в субтеломерных областях[14]; тогда как основной функцией другого (Rif1 и Rif2) является участие в регуляции длинытеломер [15, 16]. Rap1 участвует в защите теломерной ДНК от избыточного действия нуклеаз, атакже от слияния теломер поскольку он ингибирует репарацию по пути негомологичногосоединения концов (NHEJ, non-homologous end joining) [17, 18].Одноцепочечную часть теломер связывает белок Cdc13.

Cdc13 и два других белка Stn1 иTen1 образуют комплекс называемый CST [19]. CST структурно и функционально похож нагетеротримерный комплекс RPA (Replication Protein A), который связывает одноцепочечнуюДНК, что играет важную роль при репликации и репарации. Подобно RPA комплексу CSTэффективно связывает одноцепочечную ДНК, однако CST обладает большей специфичностьюи сродством к теломерной оцДНК. Поэтому он предотвращает накопление на оцДНК теломерRPA (и привлекаемой этим комплексом киназы Mec1), а, следовательно, и остановкуклеточного цикла и привлечение систем репарации.

Однако, следует отметить, что CST непредотвращает связывание других участников ответа на повреждения ДНК: комплекса MRX(состоит из белков Mre11, Rad50, Xrs2) и ассоциированной с ним киназы Tel1 [20]. CSTзащищает С-цепь теломер от деградации нуклеазами [21]. Помимо выполнения защитныхфункций CST комплекс также важен для регулирования синтеза теломерной ДНК (причём, какG-цепи, так и С-цепи), поскольку белок Cdc13 взаимодействует как с теломеразой, так и срепликативной полимеразой [22, 23].Другим важным теломерным компонентом является гетеродимер Ku70/Ku80.

Его точноеположение на теломерной ДНК неизвестно, но предполагают, что он связывается на границедвуцепочечной и одноцепочечной частей теломеры [24]. Ku70/Ku80 играет защитную роль: онтакже защищает С-цепь теломер от избыточной деградации нуклеазами [25, 26]. S.

cerevisiaeобладает ещё одним интересным белком, содержащим MYB домен, Tbf1. Этот белок оченьсхож с основными компонентами теломерного комплекса млекопитающих (TRF1 и TRF2) по9нескольким параметрам: MYB домены этих трёх белков обладают высокой степеньюгомологии, Tbf1 содержит TRFH домен (как TRF1 и TRF2), и все три белка связываютпоследовательности TTAGGG [27].

Однако, в то время как TTAGGG являются теломернымиповторами в случае млекопитающих, у S. cerevisiae TTAGGG содержатся только всубтеломерных областях хромосом [28]. Тем не менее, Tbf1 играет роль в регуляции длинытеломер [29, 30].Недавно структурные и биохимические исследования связывания белков Rap1, Rif1 иRif2 с теломерной ДНК позволили предложить модель организации высшего порядка теломер[31]. Тетрамеризация Rif1, полимеризация Rif2 и взаимодействие обоих с Rap1 – являютсяэлементами для построения особой структуры теломер, напоминающей застёжку типа"липучка". Такая структура обеспечивает необходимую защиту теломерной ДНК, оставляя в тоже время возможность регуляции; поскольку все взаимодействия являются слабыми, иструктура может быть легко разобрана (Рисунок 2.3).Рисунок 2.3. Модель организации высшего порядка теломер, образуемая за счётвзаимодействий межу белками Rap1, Rif1 и Rif2 [31].В других видах почкующихся дрожжей Rap1 тоже считается основным белком,связывающим двуцепочечную часть теломер [10].

Гомологи белка Rap1 есть у многихэукариотических организмов, в том числе у различных видов грибов, растений имлекопитающих. Однако, по крайней мере, у делящихся дрожжей и млекопитающих Rap110напрямую не связывает теломерную ДНК; а ДНК-связывающая способность ScRap1 возможноявляется следствием дупликации центрального MYB домена [32]. Два других домена белкаRap1 (N-концевой BRCT домен и C-концевой домен (RCT)) присутствуют практически у всехэукариот, за исключением некоторых видов.

Например, почкующиеся дрожжи Yarrowialipolytica не имеют явного гомолога белка Rap1 [10]. У некоторых видов почкующихсядрожжей рода Candida (включая Candida albicans) гомологи Rap1 не имеют С-концевогодомена [33]. Поскольку этот домен играет ключевую роль в регуляции длины теломер уS. cerevisiae, то его отсутствие в других дрожжах свидетельствует о значительных различиях вмеханизмах поддержания длины теломер среди почкующихся дрожжей.Yarrowia lipolytica наиболее эволюционно удалены от остальных видов почкующихсядрожжей (Рисунок 2.2), и это отражено в структуре их теломер.

Двуцепочечный участоктеломер Y. lipolytica связан особым MYB-содержащим белком YlTay1. MYB домен белкаYlTay1 более похож на таковые белков TRF1 и TRF2, чем на MYB домены других белковпочкующихся дрожжей, в том числе и ScTbf1. Вдобавок, в геноме Y.

lipolytica присутствуетгомолог белка ScTbf1 (YlTbf1), хотя его функция в качестве теломерного белка ещё неисследована. Эксперименты по связыванию YlTay1 с теломерной ДНК in vitro подтверждаютего сходство с TRF белками: обнаружено формирование структуры напоминающей теломернуюпетлю млекопитающих [34, 35].Гомологи белка Rif1 обнаружены во всех исследованных почкующихся дрожжах (атакже в других видах грибов, насекомых и позвоночных). Выделяют три консервативныхдомена в составе Rif1: HEAT повторы, SILK-мотив и особый ДНК-связывающий домен, хотявзаимное расположение этих доменов различно для разных типов организмов [36].