Автореферат (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ), страница 9

Кинетическиеисследования показывают, что по сравнению с ферментом дикого типа, замена Arg 403 нанейтральный Leu приводит к уменьшению каталитической эффективности окисления ЛКболее чем в 3 раза. Напротив, замена Arg403 на Leu не влияет существенно ни напозиционную специфичность фермента при окислении АК, ни на эффективностьферментативного катализа (табл. 6). Эти данные, в сочетании с результатамимоделирования, показывают, что, хотя Arg403 и может быть вовлечен в процесссвязывания с карбоксильной группой субстрата, в случае с АК остаток Arg 403 играет менеевыраженную роль в ее позиционировании в полости субстрат связывающего карманафермента. Анализ структуры фермента показывает наличие других положительнозаряженных остатков (Arg166, Lys172) в непосредственной близости от Arg403.

Эти остаткиобразуют положительный потенциал, слагаемый суммой диполей элементовполипептидной цепи, который может оказывать влияние на ориентацию ПНЖК в процессефермент-субстратного связывания даже в отсутствии Arg403.r12/15-LOX проявляет по отношению к АК двойную позиционную специфичность, прикоторой хиральные продукты [15(S)-HpETE и 12(S)-HpETE] реакции окисления могут36образовыватьсяРис.

17. Анализ ВЭЖХ вторичныхпродуктовокисленияМе-АКr12/15-LOX и ее R403L мутантомна обращенной фазе.одновременно.Какдляфермента дикого типа, так и его мутанта, 15(S)H(р)ETE является основным продуктом, в товремя как вклад 12(S)-H(р)ETE в общую долюферментативных продуктов незначителен. Приисследовании полученных нами препаратовr12/15-LOX на долю 15(S)-H(р)ETE приходилось>95% и примерно 90% общего продуктафермента дикого типа и мутанта R403L,соответственно. При использовании Ме-АК вкачестве субстрата доля 15(S)-Н(р)ETE (послещелочного гидролиза) слегка уменьшалась до82% для фермента дикого типа и до 86% длямутанта R403L. Анализ вторичных продуктовокисления под действием r12/15-LOX показалпреимущественное образование: 5,15-DiH(р)ETE,тогда как действие мутанта R403L приводило кобразованию 8,15-DiH(р)ETE (рис.

17). Сдвигпозиционнойспецифичностипозволяетпредложить, что в отличие от фермента дикоготипа, в случае мутанта R403L субстрат принимаетальтернативнуюконформацию,котораяобеспечивает его более глубокое проникновениев полость активного центра. Моделированиепозволяет предположить, что потеря ионныхвзаимодействий при замене Arg403 можетпривести к структурным изменениям 2 спирали,о чем свидетельствуют различия в траекторияхфермента дикого типа и мутанта R403L. Вчастности, у мутанта R403L начальный сегмент 2-спирали и N-концевой домен сильнееотдаляются друг от друга, что не происходит в случае фермента дикого типа. Такимобразом, потеря электростатического взаимодействия между этими структурнымиэлементами может также способствовать дестабилизации 2 спирали, как это происходитпри потере гидрофобного взаимодействия N-концевого домена с ее основанием.Полученные данные свидетельствуют о том, что хотя Arg403 и не является необходимойдетерминантой субстратного связывания, его взаимодействие с карбоксильной группойсубстрата может привести к перераспределению ионных взаимодействий, которое можеттакже вносить свой вклад в конформационные переходы в молекуле фермента.4.2.

Исследование межмолекулярных контактов r12/15-LOX в растворе4.2.1. Термодинамическая устойчивость димеров липоксигеназы вкристалле. Структура кристаллографического комплекса r12/15-LOX с ингибиторомпредставляет собой димер, состоящий из двух отличающихся друг от друга конформеров37А и Б (Choi J. Et al. Proteins. 2008. V. 70. P. 1023–1032). Конформер А представляет собоймолекулу r12/15-LOX, не содержащую лиганда, в то время как конформер Б связан смолекулой ингибитора и отличается по структуре от конформера А в области внешней 2спирали (рис.

18А) и 18 спирали, ограничивающей внутреннюю полость субстратсвязывающего кармана. С целью изучения стабильности подобной межмолекулярнойорганизации были проведены термодинамические расчеты, учитывающие различныевозможности ассоциации мономеров в димере: А:А, Б:Б и А:Б. Многочисленныетеоретические варианты объединения конформеров А и Б в димеры (рис. 18Б)Рис.18. Димерный интерфейс r12/15-LOX и варианты объединения мономеров.Таблица 7. Термодинамическая устойчивость димеров r12/15-LOX.Димерный интерфейсr12/15-LOX (PBD: 2Р0М)ВЕРХ-к-ВЕРХУ (A:Б)СПИНА-к-СПИНЕ (A:Б)КоличествоаминокислотПлощадь[Å2]ΔGintинтерфейса[ккал/моль]ΔGdissдиссоциации[ккал/моль]37:331335-251026:31899-10-1обнаружили отрицательную энергию диссоциации (ΔGdiss<0), что предполагает отсутствиестабильными гомодимеров в водных растворах.

Напротив, асимметричный интерфейс«ВЕРХ-к-ВЕРХУ» в кристалле на основании расчетов свободной энергии (табл. 7)является термодинамически наиболее выгодным.4.2.2. Влияние внешнего окружения на структуру r12/15-LOX в растворе. Вотличие от структуры в кристалле, исторически считалось, что в растворе r12/15-LOXприсутствует главным образом в виде мономера.

Подобное расхождение данныхтребовало детального изучения молекулярной организации r12/15-LOX в водномрастворе. Для этой цели методом МРР10 было исследовано влияние концентрациифермента, рН и ионной силы раствора на структуру r12/15-LOX. При низкихконцентрациях белка экспериментальные кривые малоуглового рентгеновского рассеяниядостаточно хорошо совпадают с расчетными кривыми (рис.

19Б), полученными на основеконформера А (PDB 2Р0М); тогда как с ростом концентрации наблюдается ихрасхождение (рис. 19А). Более подробный анализ экспериментальных данных в условиях10Измеренияметодом МРР поведены на разгонном кольце DORIS немецкого синхротронасовместно с группой д.х.н. Д.И. Свергуна, Европейская лаборатория молекулярной биологии, г.Гамбург, Германия38Рис. 19. (А и Б) Экспериментальные кривые МРР (черные точки) и модельполученная на основе линейной комбинации мономера и димера r12/15-LOX (краснаялиния).

Экспериментальные данные скорректированы с учетом экспериментальныхкривых МРР буфера, не содержащего фермента. (В) Зависимость радиуса вращенияот экспериментальных условий (■-рН 8.0; ●-рН 6.8; □-рН 8.0 и 200мМ NaCl; ○-рН 6.8 и200мМ NaCl. (Г) Влияние ионной силы раствора на структуру низкого разрешениямономера r12/15-LOX. На рисунке представлено сопоставление кристаллическойструктуры мономера r12/15-LOX со структурой низкого разрешения фермента дикого типа врастворе в различных условиях.возрастающей концентрации фермента и ионной силы раствора (от 0 до 200 мкМ NaCl)предполагает образование полидисперсной системы.

Зависимость величины полученногорадиуса вращения частиц (Rg) от концентрации белка (рис. 19В) при рН 6,8 показываетлинейное увеличение значения Rg с повышением концентрации фермента. Так как дляанализа были выбраны образцы без каких-либо признаков неспецифической агрегации,наличие полидисперстности можно объяснить смещением равновесия мономер-димер всторону образования димеров белка. При рН 8,0 подобная зависимость была менеевыражена, что, по-видимому, связано с более высокой степенью гидратации молекулыфермента в основной среде.

Интерпретация экспериментальных данных была проведенана основе моделирования с использованием метода «жесткого тела» (rigid body modeling,программа «SASREF»), учитывающего возможность пространственной подвижности NТаблица 8. Доля мономеров и димеров в водных растворах r-12/15-LOX.pHконцентрациябелка(мг/мл)6,88,00,81,62,90,71,22модель на основекристаллической структурыχ2,691,411,731,101,101,38долямономеров(%)908778879484долядимеров(%)10132213616χ фактор расхождения39модель с учетом подвижностиN-терминального доменаχ2,691,271,341,061,071,22долямономеров(%)928878879685долядимеров(%)8122213415терминального домена по отношению к каталитическому домену и равновесия в рядумономер-димер r12/15-LOX (А:Б, PDB 2Р0М) (табл.

8). Анализ полученных результатовпоказал, что в условиях буфера с низкой ионной силой (20 мМ Тris) даже при высокойконцентрации белка доминирующая фракция фермента находится в мономерномсостоянии (>78%), не обнаруживая при этом каких либо признаков междоменовойподвижности. И напротив, при наличии физиологических концентраций соли (200 мМNaCl) значения Rg существенно возрастали (рис. 19В) и доля димеров увеличивалась до25% при рН 6,8 и 35% при рН 8,0.

Хотя доля димерной фракции (25%-35%) в зависимостиот экспериментальных условий увеличивалась незначительно, анализ полученныхрезультатов позволил предположить, что увеличение радиуса молекулы ферментапроисходило главным образом вследствие отдаления N-терминального домена откаталитического домена (рис. 19Г).4.2.3. Влияние лиганда на структуру r12/15-LOX.

Липоксигеназы обладаюталлостерическими свойствами, однако механизмы аллостерического контроля остаютсянеизученными. Исходя из наличия равновесия в ряду мономер-димер, можнопредположить, что известный аллостерический эффектор, 13(S)-H(p)ODE, индуцируя рядконформационных изменений в молекуле фермента, приводит к сдвигу равновесия всторону образования димерного комплекса r12/15-LOX. С целью изучения возможностиобразования подобных переходных межмолекулярных ассоциаций r12/15-LOX поддействием 13(S)-H(p)ODE было исследовано влияние этого эффектора на размер иРис. 20.

(А) Экспериментальные данные и модель, полученная на основе линейнойкомбинации мономера и димера r12/15-LOX, построенного по принципу P2-симметрии(черные точки и кривая 1), без лиганда и фермента в присутствии лиганда (красныеквадраты и кривая 2). Экспериментальные данные скорректированы с учетомэкспериментальных кривых МРР буфера, не содержащего фермент, а также буфера,содержащего 13(S)-HODE в соответствующих концентрациях. (Б) Димерныйинтерфейс r12/15-LOX в кристалле (код 2P0M). (В) Сопоставление кристаллическойструктуры мономера, димера и моделей, полученных на основе моделирования.структуру ассоциатов фермента в растворе с помощью метода МРР.40В присутствии 10-кратного мольного избытка 13(S)-HODE наблюдалось увеличение Rg с3,3±0,1 нм до 4,2±0,1 нм, т.е.

величине, которая близка к значению теоретического Rg (4,1нм), рассчитанного для димера в кристалле (PDB идентификатор: 2P0M). Сравнениеэкспериментальных кривых показало заметное расхождение в области s<0,3 нм-1 исистематические отклонения в диапазоне величин s между 0,6 и 1 нм-1 (рис. 20А). Вотсутствии признаков неспецифической агрегации белков полученное расхождениеможно объяснить как сдвигом равновесия в ряду мономер-димер, так и повышеннойподвижностью N-концевого домена по отношению к каталитическому домену, чтоприводит к увеличению радиуса молекулы.