Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Данная система действительно является натнвной системой ш Иго, так как транскрипция осуществляется тем же самым ферментным аппаратом, который обеспечивает экспрессию собственного клеточного генома. Но система оказывается в непривычной ситуации в том отношении, что в используемой матрице могут содержаться гены, которые в обычных условиях в этих клетках не транскрибируются. Во всех трех системах подходы, использующиеся лля характеристики промотора, одинаковы.
Исследователь стремится 1п ИЗго внести в матрицу определенные изменения и только после этого помещает ее в систему транскрипции. Если оказывается, что определенный фрагмент ДНК способен инициировать транскрипцию, то делается вывод, что он способен выполнять функцию промотора. Затем определяют границы последовательности, образующей данный промотор. Для этого уменьшают размеры фрагмента с каждой из сторон до тех пор, пока в некоторой точке не пропадает ннициирующая активность. Обычная схема такого эксперимента приведена на рис. 11.б. Левую границу промотора, находящуюся против хода транскрипции, можно легко определить, прослеживая постепенное удаление оснований с соответствующего конца фрагмента до тех пор, пока промотор не перестанет функционировать. Для определения границы промотора, находящейся по ходу транскрипции, необходимо сконструировать ДНК, в которой укороченный промотор повторно пришивается к транскрибируемой последовательности (поскольку иначе отсутствует продукт, необходимый для тестирования).
При выполнении этих экспериментов необходимо соблюдать ряд предосторожностей, позволяющих избегать нежелательных эффектов. Вероятно, для узнавания РНК- полимеразой ДНК необходимо выполнение определенных топологических требований; поэтому в таких экспериментах последовательность промотор — ген обычно помещают вслед за стандартной последовательностью ДНК.
Это позволяет избегать влияния, обусловленного близостью к концу фрагмента, когда функционирование промотора прекращается просто потому, что он расположен слишком близко к концу фрагмента ДНК. Кроме того, это гарантирует стандартное окружение фрагмента прн исследовании его промоториой функции. В системах 1п кйго, в которых терминирование транскрипции, возможно, происходит недостаточно эффективно, матрица может быть разрезана на некотором расстоянии от промотора (обычно около 500 п.н. по ходу транскрипции); зто дает гарантию того, что все полимеразы пройдут одинаковое расстояние, образовав идентичные транскрипты. После того как границы промотора уже определены, можно исследовать значение конкретных оснований, вводя точковые мутации или используя другие способы изменения последовательности ДНК.
Как и в случае бактериальной РНК-полимеразы, такие мутации можно охарактеризовать как усиливающие или ослабляющие транскрипцию. Некоторые из этих изменений могут сказываться только на скорости инициирования транскрипции, другие могут влиять на ее специфичность, так как приводят к изменению местоположения стартовой точки. Для уверенности в том, что мы имеем дело с молекулами, ко- торые можно сравнивать, в каждом случае необходимо охарактеризовывать 5'-конец РНК так, как это было показано на рис. 1Ь2. В системе 1п и1го РНК-полимераза П функционирует правильно Результаты, получаемые в системе 1п чйго, в большинстве случаев можно интерпретировать непосредственно.
Последовательность ДНК, расположенная левее стартовой точки, можно удалить без сколько-нибудь заметного влияния на транскрипцию вплоть до точки, локализованной где-то между положениями — 45 и — 30. Точные координаты варьируют в зависимости от конкретной системы, но всегда определяются левее блока ТАТА. Если же продвинуться далее этой области, то транскрипция подавляется в двадцать раз и более.
Рассмотренные ланные соответствуют нашим представлениям о бактериальном промоторе, который представляет собой короткую и четко ограниченную последовательность, расположенную непосредственно слева от стартовой точки. Правая граница промотора варьирует. В двух хорошо охарактеризованных случаях она располагается приблизительно между положениями — 10 и — 12; видимо, последовательность, расположенная непосредственно слева от стартовой точки, имеет менее важное значение.
В этих случаях при делеции стартовой точки инициация происходит в сайте, который расположен на еом эюе рассеолнии от промотора, что и первоначальная стартовая точка Наблюдаемые при этом отклонения, которые могут составлять одно или два основания, связаны с поиском пурина (обычно остатка А), с которого инициируется транскрипция. Однако в отсутствие первоначальной стартовой точки эффективность инициации может быть несколько снижена.
В другом случае нужная для инициации последовательность простирается до положения + 6 и, следовательно, включает в себя стартовую точку. Мы точно не знаем, какая особенность последовательности ДНК в пределах этой границы необходима для узнавания РНК-полимеразой. Поскольку стартовая точка далеко не всегда попадает в эту область, можно заключить, чзо от геометрии комплекса зависит, в каком месте происходит инициация. Возможно, когда фермент связывается слева от стартовой точки, комплекс способен вытягиваться по направлению хола транскрипции. Блок ТАТА всегда расположен внутри промоторной области; его особое значение для транскрипции подтвердилось в опытах с введением двух мутаций в ген, кодирующий кональбумин у цыпленка.
Замена Т в третьей позиции блока Хогнесса на О приводит к возникновению мутации, сильно ослабляющей транскрипцию ~ена. Эффект этот обусловлен ие просто изменением состава пар оснований, так как замена, приводящая к появлению А, оказывает такое же действие (при этом только изменяется ориентация пары Т вЂ” А). Следовательно, важное значение имеет, видимо, точная последовательность блока ТАТА. Как было показано, этой области достаточно для инициирования транскрипции ш чйго, Об этом свидетельствует тот факт, что последовательность положения от — 32 до — 12, относящаяся к области поздних генов транскрипционной единицы аденовируса, встроившись в различные участки ДНК бактериальной плазмнды, способна инициировать транскрипцию на расстоянии 30 и.н.
от места своего включения. Все эти результаты были получены 1п чйто с одной 11. Промоторьг: сайты инициации транскрипции 151 Исследуемая область Флалк веющая область мбубсеягхьсобобоясхсхчххумххребххсобхмстясбрбгкчуогуечхтуссстубо йь Стартовая то ка ! ДЕПЕЦИИ пеотив хода ТРАИСНРИ. ПЦИИ ЛЕЛЕЦИИ по ходу теднскри" пции Рнс. Ы.б. Границы промотора могут быть определены с помощью делецнй. С каждого конца исследуемой областн создаются делецнв.
Если одна делецня не в состояннн повлнять на синтез РНК, а следующая уже астана- и той же системой из культуры клеток млекопитающих. Является ли свидетельством эволюционной консервативности способность данной системы функционировать в присутствии не ~олько генов млекопитающих, но также и генов птиц и насекомых? Для гена, кодирующего фиброин у насекомых, была получена аналогичная система из шелкоотделительной железы шелкопряда. И в этом случае у промотора обнаружены точно те же самые пределы — положения от — 29 до + б.
Однако бесклеточный экстракт из шелкоотделительной железы шелкопряда транскрибирует гены фиброина приблизительно в три раза более эффективно, чем аденовирусную ДНК, тогда как экстракт клеток млекопитающих функционирует в три раза лучше с аденовирусной ДИК, для которой он является гомологнчной системой. Система нз шелкоотделнтельной железы шелкопряда также специфически повышает эффективность транскрипции гомологичного гена фиброина, если сохраняется последовательность, расположенная левее от положения — 73.
Обнаружение этого вливает его, то граница промотора находится между ними. (В случае мутацнй, расположенных по ходу транскрипции, последовательность, вюдящая в состав травскрнпцнонной еднлющ, изменяется.) эффекта только в гомологичной системе наряду с тенденцией каждой системы тп уйго работать более эффективно в присутствии гомологичной матрицы говорит о том, что уп уйго мы изучаем только те свойства промотора, которые могут преодолеть вндоспецифические барьеры. Но фактическая функция промотора является безусловно более обширной. Промоторы РНК-полимеразы 11 мнОГОкомпонентны При анализе промоторных участков гп ейго обнаружен некоторый элемент, отвечающий по своим свойствам концепции бактериального промотора. Это короткая и хорошо охарактеризованная последовательность, располагающаяся сразу левее стартовой точки (против хода транскрипции).
В системе ооцитов или тп огцо мы обнаруживаем силь- 152 Часть П1. Синтез РНК Ген силе оддддмор~ъярсбрссдброж ообоб зсконцеааи далецил е линкер дсконцеаал делении е лин ер бчсссрхбь'сбобцжюдсксксжсбогббь адреса е и аоссоедннанне лик корон сан Обласса сена, ммещен ан линкером рвс. !!.7. Метод сканирования лннкером позволяет заменить короткую последовательность гена дикого типа последовательностью линдера, точно соответствующего пс размеру вводимым делепням. ную зависимость в функционировании промотора от последовательностей, расположенных против хода транскрипции от блока ТАТА.
Коорлннаты этих последовательностей варьируют, но в бодьшинстве случаев они располагаются на расстоянии 40 п.н,от блока ТАТА. Прн удалении этой области наблюдается снижение частоты инициации со стартовой точки примерно до 2% по отношению к начальному уровню. В противоположность этому, если удаляется ТАТА-блок, то инициация продолжается, однако стартовая точка не имеет точной локализации. Более детальный анализ последовательностей, необходимых для функционирования промотора, производится с помощью метода сканирования линнерпм. Этот подход позволяет вводить наборы мутантных последовательностей в определенные участки гена.
Постановка опыта изображена на рис. 11.7. В область исследуемого гена вводят делеционные мутации. В олпом случае создается набор фрагментов, имеющих делецни с 5'-конца гена, в другом случае-с 3'-конпа. Делектируемые области заменяются последовательностью линкера, который представляет собой короткий синтетический олигонуклеотид, содержащий участок узнавания определенной рестриктазой. Фрагменты обоих типов расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой и затем соединяют друг с другом, таким образом, чтобы произошло объединение линкеров (смотри реакцию расщепления рестриктирующими ферментами в гл.
17). В результате описанных манипуляций происходит замена первоначальной области гена, которая делетирована, последовательностью линкера. Используя наборы 5'- и 3'-концевых делеций, захватывающих разные участки бена дикого типа, таким образом можно кпросканировать» всю исследуемую область, определяя ее чувствительность к мутациям. С помощью такого подхода было установлено, что в промоторной части гена тимццин-киназы вируса герпеса имеется три различных элемента.
Область, окружающая ТАТА-блок, необходима для точной инициации. Две другие обособленные области, локализованные между положениями — 47 н — 61, а также между — 80 и — 105, нужны для эффективного протекания этого процесса. Оказалось, что прн одновременном введении мутаций в оба участка наблюдается тот же самый эффект, что и при введении мутации в один из них.
Из этого следует, что эти области выполняют сходную функцию. Такая многокомпонентная организация означает, что нельзя исследовать внутреннюю структуру промотора, просто делетнруя его отдельные участки. Наблюдаемое при этом исчезновение функции может быть вызвано изменением критических расстояний между компонентами системы, даже если делетнруемая последовательность сама по себе не несет какой-либо информации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
