Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 64
Текст из файла (страница 64)
В резуль~ате образуются фрагменты, размеры которых при электрофоретическом разлелении соответствуют местам разрывов. Это дает возможность локализовать те точки, в которых предшествующая модификация нредотвраи1ает связывание РНК-полнмеразы с ДНК. Аналогичные эксперименты можно осуществить, проводя алкилирование фосфодиэфирного каркаса ДНК. В результате этих экспериментов было показано, что большинство точек, по которым происходит взаимодействие фермента с ДНК, содержится в областях — 35 и — 10. В пределах этих областей одни и те же группы оснований, будучи способными предотвращать связывание, если онн предварительно были модифицированы, проявляют повышенную или пониженную чувствительность к модификации после связывания фермента. На рис.
11.5 точки контакта сравниваются с сайтами, затронутыми мутациями. Хотя они не совпадают полностью, но присутствуют в олних и тех же небольших областях. В этих двух участках общая длина контактирующей области составляет 12 — 15 п.н., что немного больше максимальных размеров консервативных участков. 11. Промоторы: сайты инициации транскрипции 147 Особенно интересно, что тождественные позиции в различных промоторах могут являться точками контакта, несмотря на то что содержат различные основания.
Из этого, очевидно, можно сделать вывод о существовании общего механизма связывания РНК-полимеразы, хотя реакция не зависит от наличия определенных оснований в какой-либо из точек контакта. Эта модель может объяснить, почему некоторые точки контакта не совпадают с сайтами, подверженными мутированию. Не каждая мутация также затрагивает точку контакта; может быть, в данном случае сказывается некоторое влияние соседних оснований, которые фактически не соприкасаются с ферментом? Узнавание промоторов и расплетание двойной спирали ДНК Особенно важно, что эксперименты с предварительной модификацией и с экранированием в присутствии фермента выявили в одной и той же области одинаковые сайты.
Эти два экспериментальных подхола дают возможность исследовать образование разных контактов. В первом случае выявляются все те сайты, которые фермент должен узнать в процессе связывания с ДНК. Во втором определяются все те сайты, которые действительно образуют контакты в бинарном комплексе. Поэтому если имеются какие-либо контакты, участвующие в первичном узнавании, но в дальнейшем не существенные для поддержания устойчивого связывания, то они были бы обнаружены как сайты, в которых предварительная модификация предотвращает связывание с ферментом, но которые не экранируются в составе бинарного комплекса. Поскольку сайты с такими свойствами не были обнаружены, а экранированные сайты включают все те, которые участвуют в узнавании, и еще ряд дополнительных позиций, то, по-видимому, фермент сначала узнает некий набор сайгон, необходимый для своей «посадкия, и только после этого образует более обширные контакты.
Дру|ой тип экспериментов по модификации позволяет непосредственно обнаружить расплетенную область ДНК, входящую в состав бинарного открытого комплекса. При разлелении цепей ДНК неспаренные аденины становятся чувствительными к дополнительному метилированию в присутствии ДМС.
Если затем фрагмент ДНК освободить от фермента, расплетенная область ренатурирует, за исключением метилированных остатков аденина, которые теперь содержат метильные группы в положении 1, принимающем обычно участие в комплементарном взаимодействии оснований. Метильные группы мешают основаниям А узнавать своих партнеров Т. Это несовершенство в спаривании можно обнаружить при помощи фермента нуклеазы $1, которая специфически расщепляет ДНК в любом одноцепочечном участке. Как обычно, результаты такого расщепления анализируют электрофоретически, определяя размеры образующегося фрагмента, меченного по концу. В результате такого эксперимента образуется набор полос с размерами, соответствующими положениям от — 9 до ч-3.
Эти данные показывают, что область, расплетаемая в реакции инициирования, включает участок, начинающийся от правого конца блока Прибнова и заканчивающийся как раз за стартовой точкой. Возможно, само расплетение начинается непосрелственно внутри блока Прибнова, но злесь его не удается зафиксировать.
(Оценка размеров расплетенного участка по степени раскручивания показала, что он составляет менее 17 и.н., см. также гл. !П) При рассмотрении в трех измерениях все точки контакта, находящиеся против хода транскрипции от блока Прибнова, располагаются на одной и той же поверхности ДНК (рис. 1!.5). Эти основания, вероятно, узнаются при первоначальном образовании закрытого бинарного комплекса. Это создает возможность для реакции узнавания между РНК-гюлимеразой и ДНК путем образования контакта межлу ферментом и одной из поверхностей ДНК, что является простейшей из возможных молелей.
После того как расплетание ДНК началось, возможно узнавание и связывание со следующими сайтами, расположенными на другой стороне ДНК. Мало что известно о точках контакта, имеющихся в составе фермента, но РНК-полимераза, находящаяся на промоторе, может быть ковалентно пришита к ДНК, в которой тимин замешен на бромурацил. При этом было показано, что а-субъединица (сигма-субъединица) взаимодействует с нематричной цепью в положении — 3, тогда как )3-субъединица контактирует с положением -ь 3. Такое расположение о-субъединицы, видимо, дает ей возможность принимать участие в поиске промотора и (или) в стабилизации первоначально расплетенной области. Но нам не известно, участвует ли <т-субъединица в этом непосредственно, или ее функция опосредована взаимодействием с коферментом.
О важном значении расплетания цепей при инициировании транскрипции свилетельствует эффект, оказываемый суперспирализацией на матричные свойства ДНК. Как мы упоминали в гл. 2, введение отрицательных сверхвитков в ковалентнозамкнутую молекулу ДНК (т.е. в молекулу, у которой нет свободных концов) сопряжено с расплетанием двойной спирали. В послелнее время стало известно, что как прокариотические, так и эукариотические РНК-полимеразы )п гйго более эффективно инициируют транскрипцию на суперспирализованных матрицах, чем на релаксированных ДНК. Возможно, это объясняется тем, что суперспирализованная структура требует меньше энергетических затрат для первоначального плавления ДНК в инициирующем комплексе.
Значение этого эффекта для контроля активности промоторов у бактерий обнаруживается при нарушениях в работе ферментов, влияющих на степень суперспирализации. К таким ферментам относятся ДНК-гираза, внося- и(ая отрицательные сверхвитки, и топоизомераза1, релаксирующая (устраняющая) отрицательные сверхвитки (гл. 32). Добавление ингибиторов ДНК-гиразы подавляет транскрипцию.
Обратный эффект, усиливающий транскрипцию, наблюдается в присутствии мутаций, инактивирующих топоизомеразу 1. Оба этих эффекта проявляются только в отношении некоторых промоторов. Все это свидетельствуе~ о том, что степень отрицательной суперспирализации ДНК оказывает влияние на эффективность работы промоторов. Ингибирование ДНК-гиразы нарушает процесс суперспирализации ДНК, подавляя в результате экспрессию определенных транскрипционных единиц. Сначала думали, что мутация в топоизомеразе 1 повышает экспрессию генов, поскольку' предотвращает снижение степени суперспирализации под действием фермента.
Однако вполне возможно, что это действие обусловлено наличием дополнительных мутаций. В целом взаимосвязь между работой топоизомеразы и транскрипцией еще недостаточна ясна. 148 Часть 1П. Синтез РНК Почему одни промоторы в отличие от других чувствительны к суперспирализации? Одна из возможностей состоит в том, что зависимость каждого промотора от степени суперспирализацни определяется его нуклеотидной последовательностью.
Это означало бы, что некоторые промоторы имеют последовательности, которые плавятся более ле~ко (а поэтому в меньшей степени зависят от суперспирализации), тогда как другие обладают более тугоплавкими последовательностями (и поэтому они в большей степени зависят от суперспирализации). Однако вполне возможно, что важную роль играет местоположение промотора, если разные области бактериальной хромосомы характеризуются различной степенью суперспирализации. Позитивная регуляция работы промоторов Итак, мы определили промотор как последовательность ДНК, способную связывать РНК-полимеразу и затем инициировать транскрипцию. Но существует ряд промоторов, на которых РНК-полимераза не способна инициировать транскрипцию в отсутствие вспомогательных регуляторных белков. Такие белки принято называть позитивными регуляторами, так как их присутствие необходимо для активирования единицы транскрипции.
Известно несколько позитивных регуляторов. Некоторые из них -это фагоспецифические белки, другие присутствуют в клетке-хозяине. Необходимо сразу сказа~ь, что мы, в сущности, не понимаем природы различий между промоторами, способными функционировать, рег эе и теми, которым необходимы позитивные регуляторы. Ряд закусон у Е, со!1 (а также у других бактерий) подвержен позитивному контролю, при котором для их экспрессии необходима высокая концентрация циклического АМР. Действие этого иуклеотида состоит в активации белка БАК (САР) или, как его еще называю~, СЯР*'- фактора. (Окончазельный выбор названия еще не сделан.) Этот белок, имеклций важное значение для транскрипции тех промоторов, которые он контролирует, представляет собою димер с мол.
массой 45000 лальтон. В гл. 15 мы более подробно обсудим роль этого белка в координации экспрессии генов. БАК непосредственно связывается с ДНК, и комплекс сАМР БАК ДНК можно выделить для любого промотора, работающего в присутствии этого белка. Получены мутации по 1ас-оперону, локализующиеся в сайте связывания, которые делают транскрипцию (п твко независимой от БАК. Эти мутации также предотвращают связывание БАК с ДНК (л чйго. В каждом промоторе сайт связывания БАК находится слева от РНК-полимеразного сайта. Во всех БАК-связывающих сайтах можно обнаружить предполагаемую 11-членную среднестатистическую последовательность, содержащую различные отклонения. Но вызывает удивление тот факт, что в ряде промоторов БАК-связывающие сайэы располагаются на различном расстоянии от стартовой точки.
Это затрудняет создание единой модели действия БАК. В )ас-олероне область ДНК, экранируемая БАК, простирается приблизительно от положения — 72 до — 52. БАК (САР) белковый ак1иватор кагаболиэма, а БРЦ (СИР) . белковый рецептор цАМР. Вероятно, что два димера белка БАК связываются с ДНК. Результаты проведенных экспериментов показывают, что БАК преимущественно располагается с одной стороны двойной спирали ДНК, причем с той самой, которая связывает РНК-полимеразу. Это позволяет расположить два белка в непосредственной близости друг от друга. Однако в да1-опероне БАК-связывающая зона находится между положениями — 50 и — 23.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
