Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 59
Текст из файла (страница 59)
10.3). Ни один из этих участков пока еще не локализован ни на одной из полипептндных субъединиц. Однако некоторая общая информация о роли отдельных субъединиц уже имеется. На р-субъединицу действуют два типа антибиотиков. Это было выяснено путем локализации мутаций, определяющих устойчивость к ним. Рифамицины (из которых наиболее широко используется рифампицин) блокирует инициацию, действуя на стадии, предшествующей формированию первой фосфодиэфирной связи. Если же эта стадия уже завершилась, то образовавшийся тройной комплекс устойчив к ннгнбированию. Стрепголиднгины ингибируют элонгацию. )3-Субъединица является мишенью и для этой группы ангибигпиков. Об этом свидетельствует тот факт, что в опытах по реконструкции именно источник добавленной (3-субъединицы определяет устойчивость к стрептолидигинам.
В-Субъединица также метится некоторыми аффинными аналогами нуклеозидтрифосфатов. Все эти данные дают основание думать, что !3-субъединица участвует в связывании нуклеотидных субстратов. Гепарни является полианноном, ко~орый взаимодействует с ()ьсубъединицей и ингибирует транскрипцию ш гй!го. Гепарин конкурирует с ДНК при связывании с матрицей до образования стабильного инициирующего комплекса. !3'-Субъединица является наиболее основной, что могло бы играть определенную роль в связывании ферменга с матрицей. Выделенная в чистом виде и-субъединица существует в форме димера, способного связываться с (3-субъединицей; затем комплекс и !3 присоединяет р', образуя минимальный фермент.
При инфицироваиии Е. сой фагом Т4 и-субъединица модифицируется в резудьтате АОР-рибозилирования аргннина. Это сопровождается уменьшением сродства к обычным промоторам, распознаваемым голоферментом. Следовательно, вполне возможно, что исубъединица играет какую-то роль в распознавании промотора. Ни .одну из субъединиц нельзя считать участком связывания для о. Все они, по-видимому, прямо или косвенно участвуют в превращении минимального фермента в голофермент. РНК-иолимеразы фа!ов, возможно, являются «минимальными» ферментами Почему для осуществления своих функций бактериальной РНК-полимеразе необходима огромная мультимериая структура? Некоторые фаги кодируют РНК-полимеразы значительно меньше~ о размера, состоящие всего лигпь из одной полипептицной цепи.
Этот факт указывает, что транскрнпционный аппарат, необходимый для синтеза РНК, может быть намного меныпе, чем тот, который имеется у клетки-хозяина. Существование таких ферментов подводит к мысли о том, что транскрипция может производиться «мнни- мальным» аппаратом, Эти ферменты узнают всего лишь несколько промоторов в фа~ овой ДНК и не могут узнавать другие.
Таким образом, свойства, присущие эгим ферментам, накладывают на них определенные ограничения, способствуя связыванию только с некоторыми специфическими участками ДНК и синтезированию РНК. Как же устроены эти ферменты? РНК-полимеразы, кодируемые родственными фагами Т3 и Т7, представляют собой полипептиды, состоящие всего лишь из одной цепи, примерно по 1!0000 дальтон каждая. Они очень быстро синтезируют РНК (при 37'С скорость синтеза составляет около 200 нуклеотидов в 1 с).
Полимераза фа~а ТЗ начинает синтез всех РНК с образования динуклеотида рррОрО, Эта характерная особенность указывает на то, что процесс инициации у фага, вероятно, проще, чем в случае полимераз Е. со(0 В отличие от этого фермент клетки-хозяина способен транскрибировать любую из многих (около !000) транскрипционных единиц. Некоторые из ннх могут транскрибироваться только полимеразой без участия каких-либо других факторов, хотя эффективность транскрипции будет зависеть от степени сродства фермента к определенному промотору. Однако многие гены транскрибируются только в присутствии дополнительных белковых факторов.
В некоторых случаях эти факгоры специфичны в отношении какой-либо одной траискрипционной единицы; иногда они участвуют в координированной транскрипции многих единиц. Заражение некоторыми фагами вызывает резкие изменения в сродстве РНК-полимеразы клетки-хозяина к промоторам, выражающиеся в том, что она перестает узнавать специфические участки своего генома, а вместо этого начинает транскрипцию на фаговых промоторах. Таким образом, ферменту клетки-хозяина приходится действовать в соответствии с различными клеточными и фаговымн функциями, что изменяет его транскрипционные свойства. Следовательно, сложность фермента может, по крайней мере частично, отражать наличие множества сигналов контроля, на которые он должен отвечать. Сложные эукариотические РНК-нолимеразы Транскрипциоапый аппарат эукариотических клеток устроен значителыю сложнее и изучен хуже, чем бактериальный.
У эукариот обнаружены три ядерные РНК-полимеразы, характеризующиеся разной локализацией и состоящие из большого числа полипептидных компонентов. Кроме того, в митохондриях и хлоропластах обнаружены другие РНК-полимеразные активности. Основная часть полимеразной активности приходится на долю РНК-полимеразы 1, которая обнаруживается в ядрышках и ответственна за транскрипцию генов рРНК. Этот фермент обеспечивает 50 — 70;~; клеточного синтеза РНК. РНК-полимераза примерно одинаково стимулируется ионами Мпх' и Мдз~. Другим важным ферментом является РНК-полимера- за Н.
Она докализована в нуклеоплазме (ядро, за исключением ядрышка); на долю этого фермента приходится 20-40;; клеточной РНК-синтезирующей активности. Он ответствен за синтез гетерогенной ядерной РНК (гя-РНК), предшественника мРНК. Фермент пампе~ о эффективнее стимулируется ионами Мп, чем ионами Мух" Синтез РНК Часть 1Н. (38 РНК-полимераза П1 представляет собой минорную ферментативную активность, обеспечивающую до 1О, клеточного синтеза РНК. Фермент находится в нуклеоплазме и осуществляет синтез многих малых ядерных РНК и тРНК. Он стимулируется ионами Мп' ' несколько эффективнее, чем ионами Мя~'. Различная зависимость активности РНК-полимераз от бивалентных катионов в свое время считалась основной отличительной особенностью этих ферментов (вот почему мы упоминаем о ней).
Сейчас же различные полимеразные активности дифференцнруют, исходя из их чувствительности к бициклическому октапептиду-и-аманитину. В клетках животных, растений и насекомых РНК-полимераза 11 быстро инактивируется низкими концентрациями и-аманитина (около 0,03 мкг/мл). Эта особенность сохраняется у довольно широкого спектра организмов.
Активность РНК-полимеразы 111 в животных клетках ингибнруется при значительно более высокой концентрации а-аманитина-около 20 мкг?мл; однако в дрожжевых клетках и в клетках насекомых этот фермент устойчив и к этой концентрации. Активносгь РНК- полнмеразы1 не иигибируется ни в каких клетках. (Это означает, что для проявления ингибирующего действия паманитина его концентрация должна быть выше 500 мкг!мл.) В неочищенных экстрактах все полимеразные активности связаны с крупными белковыми агрегатами с мол. массой от 500000 дальтон и более и со сложным субъединичным составом. Каждый фермент имеет две большие субъединицы-одна из них с мол.
массой примерно 200000 дальтон, другая-около 140000 дальтон,-и до 10 маленьких субъединиц, варьирующих по молекулярной массе от 10000 до 90000 дальтон. Являются ли какие-либо из этих субъединиц одинаковыми или сходными у разных полимераз, пока не известно. Посхольку ни одну из этих РНК-полимераз до сих пор не удалось реконструировать из субъединиц, остается неясным, все ли белковые субъединицы входят в состав каждого фермента. Не известно также, какие из них отвечают за каталитическую активность и могут лн остальные выполнять регуляторные функции, Возможно, что ферментные препараты представляют собой основные транскрипционные комплексы-в общем сходные для всех клеток, но регулируемые дополнительными белковыми факторами.
Или, скажем, эти факторы могут входить в состав фермеитного препарата в такой же степени, как и основной каталитический комплекс. Иными словами, остался нерешенным следующий важный вопрос, связанный с устройством транскрипционных аппаратов: способны ли компоненты выделяемого транскрипционного комплекса самостоятельно решать, какие гены следует транскрибнровать, или же для этого необходимы вспомогательные белковые факторы, которые еще надлежит идентифицировать? Выделенные ферментные препараты можно использовать для синтеза РНК (п чйго. Были разработаны некоторые гетерологичные системы, в которых инициация происходит в соответствующих промоторных участках. Так, например, препарат РНК-полимеразы 11 из культуры человеческих клеток КВ может транскрибировать глобиновый ген мьппи. Это означает, что для узнавания промотора РНК-полимеразой не имеют значения ни тканевые, ни видоспецифические особенности.
Следовательно, существует некая универсальная и консервативная структура, которая узнается как промотор. Конечно, это не исключает возможности того, что в естественных условиях дополнительные белковые факторы и другие последовательности ДНК участвуют в модулировании РНК-полимеразной реакдии. В другой модельной системе РНК-полимеразаП1 из Хелорих !иеей может специфически транскрибировать гены 5б-РНК только в том случае, если в систему добавлен дополнительный белковый фактор, полипептид с мол. массой 37000 дальтон, находящийся в ооцитах в комплексе с 5б-РНК.
По-видимому, этот вспомогательный белок необходим для основного транскрипционного комплекса, работающего с генами 5Б-РНК, но не нужен для транскрипции других генов„поскольку гены тРНК могут транскрибироваться РНК-полимеразой П1 без какого-либо фактора (гл. П). Поскольку общая сложность транскрипционного аппарата эукариот выявляется только в различных конкретных системах, в настоящее время можно с уверенностью говорить о существовании трех мультимерных ферментов, необходимых для синтеза РНК.
Все ли их компоненты имеют одинаково важное значение и сколько при этом требуется других белковых факторов-пока не известно. РНК-полимеразы митохондрий и хлоропластов имеют, по-видимому, меныпие размеры и отличаются от ядерных ферментов. Безусловно, ~ еном этих органелл намного меньше клеточного генома, и собственным полимеразам нужно транскрибировать только ограниченное число генов; следовательно, и транскрипционный контроль у них может быть более простым. Эти ферменты могут быть аналогичны фаговым полимеразам, отвечающим за транскрипцию только определенных единичных генов и не способных отвечать иа более сложные сигналы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
