Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Рабочий цикл сигма-фактора Сигма-фактор нужен только для инициации. Он сразу же освобождается из комплекса с минимальным ферментом, как только начинается синтез РНК. После того как сформируется открытый (бинарный) комплекс, следующим шагом является включение двух первых нуклеотидов и образование фосфодиэфирной связи между ними. Это приводит к образованию тройного комплекса между минимальным ферментом ДНК н синтезирующейся РНК (рис.
!О.!). Данная реакция протекает настолько быстро, что период полужизни бинарного комплекса в участке прочного связывания составляет всего лишь 0,2 с. Инициация заканчивается формированием тройного комплекса, и сигма-фактор уже не является его составной частью. Прямая взаимосвязь между освобождением сигма- фактора и синтезом фосфодиэфирной связи неизвестна. Возможно, сигма-фактор непосредственно замещается дннуклеотидом образующейся РНК; возможно также, что его удаление из комплекса может быть индуцировано изменением свойств минимального фермента, происшедшим под воздействием синтезирующейся РНК.
В любом случае, начиная с момента образования первой фосфодиэфирной связи, транскрипция осуществляется тройным комплексом, содержащим минимальный фермент. Минимальный фермент в составе тройного комплекса очень прочно связан с ДНК. Он как бы заперт в нем до тех пор, пока не закончится элонгация. Когда же транскрипция завершается, минимальный фермент отделяется от ДНК в виде свободного белкового тетрамера. Как показано на рис. 10.2, освободившийся минимальный фермент затем должен найти другой сигма-фактор и включиться в следующий цикл транскрипции, Наличие цикличности во временном объединении сигма-фактора с минимальным ферментом решает дилемму, стоящую перед РНК-полимеразой: привести в соответствие взаимодействие фермента с матрнцей при инициации и элонгации. Это в самом деле дилемма, поскольку для инициации требуется прочное взаимодействие только с определенными последовательностями (промоторами), тогда как при элоигации необходимо прочное связывание со всеми последовательностями, вдоль которых происходит движение фермента.
Минимальному ферменту присуще высокое сродство к ДНК, которое увеличивается в присутствии новосинтезированной РНК. Однако его сродство к слабым участкам связывания слишком велико, чтобы позволить ферменту эффективно находить промоторы. При этом поиск участков прочного связывания методом проб и ошибок путем ассоциации и диссоциацни может длиться много часов. Сигма-фактор значительно ускоряет этот процесс, уменьшая стабильность слабых комплексов. В то же время, стабилизируя ассоциацию в участках прочного связывания, сигма-фактор необратимо сдвигает реакцию в сторону образования открытых комплексов. Но затем действия голофермента «паралнзуются» его же собственным специфическим сродством к промоторам.
Поэтому, освобождаясь от сигма-фактора, фермент снова способен связываться с любой последовательностью ДНК, что позволяет ему продолжать транскрипцию. Минимальный фермент синтезирует РНК РНК транскрибнруется только с одной цепи ДНК-матрицы. Для осуществления этого процесса пепи ДНК должны быть локально расплетены в данном участке. Минимальный фермент начинает транскрипцию на расплетенных цепях ДНК открытого промоторного комплекса. По мере передвижения фермента вдоль матрицы и роста цепи РНК область локального расплетения цепей движется вместе с инм.
Участок матрицы, ассоциированный с ферментом, составляет около 60 нуклеотидов, однако область локального расплетения депей будет короче, и точно оценить ее размер довольно трудно. Судя по чувствительности ДНК в открытом комплексе к иуклеазе, специфичной к одноцепочечным участкам, длина расплетенно~о участка равна !2 парам нуклеотидов (гл. 11). Если же РНК-полнмеразная реакция протекает на кольцевых двуспиральных молекулах ДНК, то протяженность неспаренного участка ДНК составляет 17 нуклеотидных пар.
По мере того как происходит расплетеиие цепей ДНК, каждая нз раздельных цепей взаимодействует с определенным участком фермента. Как показано на рис. 10.3, одноцепочечный участок матрицы, расположенный перед точкой присоединения первых рнбонуклеотидов цепи РНК, будет находиться в свободном состоянии, а в том месте, где только что прошел синтез РНК, он будет существовать в форме гибрида ДНК вЂ” РНК. Таким образом, протяженность гибридной области может быть несколько меньше, чем расплетенный участок ДНК.
Видимо, гибридный комплекс ДНК вЂ” РНК имеет в длину 12 пар нуклеотидов. 1Зб Часть 111. Синтез РНК Непраале ие даик еиип Еермен е ГМмуо Компленеиуарим цепь ДЙК Ммм еппеуеиип еоы ДНК ок ции циируошепо укл оу ла Рнс 1О 3 РНК-цоднмераза экраннруег участок ДНК примерно в бо цар нуклеотндон; она имеет несколько активных центров. После того как РНК-полимераза продвинулась далее по матрице, в оставленном позади нее расплетенном участке восстанавливается двухцепочечная структура ДНК, а РНК вытесняется в виде свободной полинуклеотидной цепи. В каждый данный момент транскрипции около 50 последних рибонуклеотидов растущей цепи находится в комплексе с ДНК и ферментом. Связанный с ферментом участок матрицы, в котором расплетаются цепи ДНК и происходит синтез РНК, иногда называют точкой роста (хотя этот термин чаще используют при описании процесса репликадии).
К сожалению, мы пока еще не понимаем топологии процесса расплетания цепей ДНК и последующего восстановления структуры двойной спирали, однако, исходя из способности очищенной РНК-полимеразы транскрибировать двуспиральную ДНК и н)Гго, можно думать, что этот процесс контролируется самим ферментом. Мало вероятно, чтобы прн этом фермент вращался вокруг оси ДНК, так как это повлекло бы за собой движение всей цепи РНК и ассоциированных с ней рибосом. Возможно, что вращательные движения совершает матрица; при этом участок ДНК, находящийся перед ферментом, вращается по направлению раскручивания н одновременно происходит закручивание цепей ДНК позади фермента — в обратном направлении. Для осуществления этого процесса ш у(но, по-видимому, необходимо участие друуих ферментативных активностей, которые соответствующийа образом изменяют пространственную структуру ДНК.
Все нуклеиновые кислоты синтезируются из предшественников-5цнуклеозидтрифосфатов, На рнс. 10.4 показана реакция полимеризации между 5цконпевой трифосфатной группой присоединяемого нуклеотида и ЗцОН- группой последнеео нуклеотида цепи. Минимальный фермент должен удерживать две реагирующие группы в таком положении, которое блау оприятно для образования фосфодиэфириой связи.
Как только ковалентная связь возникла, фермент продвигается далее по матрице на один нуклеотид, с тем чтобы повторить реакцию. Скорость реакдни при 37оС высокая-около 40 присоединенных нуклеотидов в 1 с (гл. 9). Как показано на рис. 10.3, последний нуклеотид растущей цепи определяет участок связывания затравки. Область, занимаемая присоединяемым нуклеозидтрифосфатом, образует участок элонгацин. Различие в природе обоих реагирующих групп стано- вится очевидным при инициации, когда фермент должен непосредственно связать два нуклеозидтрифосфата, Первое основание в цепи РНК чаще всего (но не всегда) является цурином, и фермент может )п уйго присоединять АТР или ОТР к участку, который отличается от участка элонгации. Ои является участком иинцинрующего иуклеотида и должен в целом перекрываться с участком связывания затравки.
Первый нуклеотид цепи содержит все три 5ьфосфатных остатка. Все четыре нуклеозидтрифосфата могут поступать в участок элонгации нуклеотидов. По-видимому, сама РНК-полимераза отбирает нужные предшественники путем спаривания новоприбывшего нуклеотида с цепью ДНК-матрицы. Возможно, структура участка элонгации такова, что фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если нуклеотид формирует правильную пару с соответствующим основанием ДНК.
Если же оказалось, что нуклеотид не способен образовать совергпенную пару, то он скорее всего удаляется и вместо него испытывается другой. (Вероятность случайного правильного выбора нуклеотида равна примерно 25;к„что намного превосходит вероятность вхождения правильной аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы, составляющую всего лишь 3;м) Для функционирования РНК-полимеразы важное значение имеют двухвалентные катионы. Рибонуклеотиды поступают в участок элонгации нуклеотидов в форме хелатных соединений Мй' ' — ХТР.
Минимальный фермент содержит два атома цинка. Возможно, что они нужны для поддержания нуклеотидов в участке связывания затравки и участке инициирующего нуклеотида в конформации, благоприятной для реакции с очередным нуклеотидом. 5.колец пап иуклеоуиаиой цепи о ! о=р — О ! о ! О =Р— О ! — обу- 'йй ! — ) О=Р о ! с 1 о н он Рнс. 104. Образование фосфоднэфнрной связи ырсдполагает гндрофндьную атаку ЗцОН-групцой последнего нукдеотнда цепи 5цтрнфосфата нового нуклеемида, сопровождающуюся освобожденном цнрофосфата. Считается, чуо нуапеоуиднаа цепь растет а нацраалении оч 5а«онца к Зьаонду, цаеаольау 5ьконец цецн остаеуса неизменным н «андый новый нуклеоунд увеличивает ее данну на одна осуаток со стороны Зьаонца. 1О.
РНК-полимеразы — транскрипционный аппарат Функции субьединиц минимального фермента Мы располагаем весьма ограниченными данными о пространственной организации минимального фермента, и самое большее, что мы можем сделать,-это построить схематическую диаграмму участков, определяющих различные ферментативные функции (как это показано на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
