Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 53
Текст из файла (страница 53)
(Конечно, такое заключение правомерно лишь в том случае, если синтезирующийся 1п гаго продукт является полноценным белком, а не артефактом, возникшим в результате неправильной трансляции. Поэтому необходимо продемонстрировать, что при друг их условиях данные белки действительно синтезируются (п Иво,) Иногда продукт трансляции, образующийся (п нгго, родствен подлинному белку, синтезирующемуся |п в1во, но содержит на )9-конце небольшую последовательность дополнительных аминокислот. Эти различия обьясняются тем, что белок, обнаруживаемый (и гпто, не является первичным продуктом трансляции, а появляется в результате расщепления предшественника, солержашего дополнительные аминокислотные остатки.
Обычно (п Ичо процессинг такого предшественника происходит быстро, и поэтому их трудно обааружить, если не применять ннгибиторов, блокирующих реакцию расщепления, Очищенные молекулы мРНК исследуют с использованием трансляционных систем двух типов. Они изображены на рис. 9.7. В состав реконструированных бесклеточных систем входят рибосомы, факторы белкового синтеза и тРНК.
Это традиционный подход, который мы уже описывали. Существует несколько таких систем: наиболее известны системы, получаемые из проростков пшеницы, регикулоцитов кролика и асцитных клеток мыши. Все они в определенной степени неэффективны, так как каждая мРНК транслируется меньшее количество раз н со значительно меньшей скоростью, чем )п в1во. Наилучшие системы функционируют на протяжении 90 120 мин. Во всех случаях обнаруживается некоторый остаточный уровень трансляции, который обусловлен неудаленной эндогенной мРНК и который у разных систем может варьировать. Часть 11.
Синтез белков 124 Рис. 9.7. Экзогенные молекулы мРНК можно транслировать в бесклетсчной системе или инъецируя их в оониты Х. !аким. Другой трансляционной системой являются интактные ооциты африканской шпорцевой лягупхки Хеиорих 1иела Инъецированные молекулы мРНК транслируются в них природным белоксинтезирующим аппаратом. Система эффективна и использует инъецированные молекулы мРНК так, как если бы они были эндогенными. Поэтому они вовлекаются в повторные циклы трансляции. Единственное ограничение состоит в том, что слишком большое количество мРНК может насытить трансляционную систему (которая, конечно, находится в болыцом избытке по отношению к эндогенным молекулам мРНК).
Как правило, система продолжает быть активной в течение 24 48 часов. В рассмотренных системах не обнаруживается тканевой или видовой специфичности. Это указывает на го, то мРНК и белоксинтезируюший аппарат (возможно) любой дитоплазмы взаимозаменяемы. Следовательно, можно сделать вывод, что в данных системах не существует контроля на уровне трансляции со стороны каких-то рибосомных факторов, которые были бы способны функционировать с одним типом молекул мРНК, а не с другим.
Трансляционный аппарат заранее не запрограммирован, а способен использовать любую мРНК в качестве матрицы. Таким образом, любой контроль па уровне трансляции должен реализоваться в форме, препятствующей молекулам мРНК взаимодействовать с белоксинтезирующим аппаратом. Наиболее вероятно, это достигается изоляцией молекул мРНК путем их перевода в форму, физически недоступную для белкового синтеза. Белоксинтезирующая система ооцитов способна осуществлять процессинг по крайней мере некоторых белков, причем сопряженное с процессингом расщепление происходит либо еще во время синтеза белка, либо вскоре после его окончания. В ряде случаев эта система даже может обеспечить проникновение белковых продуктов в необходимый компартмент клетки. Таким образом, снг- палы процессинга могут быть общими для различных типов и видов клетки.
В качестве практической рекомендации можно отметить, что получение белков-предшественников должно осуществляться в бескдеточной системе трансляции. Для инициации, по-видимому, необходимо комнлементарное взаимодействие между мРНК и рРНК Участки мРНК, взаимодействующие с рибосомами при инициации белкового синтеза, могут быть идентифицированы по образованию стабильного комплекса между рибосомами и мРНК в условиях, препятствующих элонгации полипептидной цепи. При добавлении рибонуклеазы к инициирующему комплексу вся мРНК, находящаяся за пределами рибосомы, деградирует, и остаемся только участок, экранированный частицей (рис. 9.8).
Защищенный фрагмент можно выделить и исследовать. Такие эксперименты были выполнены с многими очищенными мРНК как бактериального, так и эукариотнческого происхождения. Бактернальные рибосомы экранируют инициирующую последовательность размером 35-40 оснований. В состав этой последовательности всегда входит инициирующий кодои А13С (илн О)3О), располагающийся на расстоянии двух третей от начала защищенного фрагмента. Наблюдается очень незначительная гомология между последовательностями, образующими участки связывания рибосом у различных бактериальных мРНК, Обнаруживается лишь очень короткая общая последовательность, комплементарная определенной области, расположенной недалеко от 3'-конца 1бб-рРНК. 3'-концевой участок бактериальной 16$-рРНК высоко- консервативен.
Так, он почти идентичен с 3'-концом со- 9. Информационная РНК как матрица для синтеза белка 125 Рнс. 9.8. Участок мРНК, связывающий рнбосому, может быть получен из состава инипинруюшсго комплекса. ответствующей рРНК из хлоропластов кукурузы. Ззконец рРНК обладает двумя особенностями, ко~орые мокнут иметь важное значение для синтеза белка. Вопервых, последовательность рассматриваемого участка является самокомплементарной и может образовывать шпильку в результате комплементарного взаимодействия оснований (рис.
9.9). Во-вторых, этот участок содержит специально обозначенную на рисунке последовательность, которая, будучи записанной в обратном порядке, выглядит как 3'.. ЛЗСС13СС...5'. За одним лишь исключением, в сайтах инициации всех известных мРНК Е. сой существует участок, комплементарный по крайней мере трем нуклсотидам этой области, а чаще — 4 5 нуклеотидам. Таким образом, бактериальная мРНК содержит или часть, или весь олигоиуклеотид 5'...АООАОО...3'. Этот полипурииовый участок часто называют последовательностью Шайна — Дальгарно.
Она располагается на расстоянии 4 7 оснований перед кодоном А13О. Происходит ли взаимодействие между последовательностью Шайна — Дальгарно н комплементарной ей областью в рРНК в процессе связывания матрицы с рибосомой? Комплементарная последовательность в рРНК не может одновременно быть частью внутримолекулярной шпильки и взаимодействовать с мРНК. Но эти два вараанта спаривания могут существовать как альтернативные. То~да инициирование может включать в себя разрушение концевой шпильки, и комплементарное спаривание между рРНК и мРНК станет в результате воз- можным.
Вслед за этим дуплекс между рРНК и мРНК может быть нарушен, а структура шпильки восстановится. Этот механизм может привести в соответствие необходимость образования стабильного инициирующего комплекса и потребность рибосомы в дальнейшем продвижении вдоль мРНК. Тот факт, что 3'-концевая область рРНК является мишенью для антибиотика касугамицина, говорит о ее участии в синтезе белка. Эта область также может быть ковалентно сшита с факторами инициации.
Основным же доводом в пользу участия последовательности Шайна— Далы арно в инициации служит тот факт, что эта последовательность повсеместно обнаруживается в инициирующих сайтах у прокариот. В одном случае это непосредственно доказано (мРНК для гена 0,3 фага Т7). При этом мутация, ведущая к изменению последовательности ОАОС на ОААО, дестабилизирует связывание рибосомы с фаговой мРНК.
Единственная мРНК, в которой отсутствует последовательность Шайна Дальгарио,— это лямдовский Р,„-транскрипт фага Х, несущий на 5зконце рррА(ЗО. Эта мРНК транслируется относительно плохо. Возможно, необычное местоположение кодона А(3Ст-непосредственно на 5-конце — позволяет рибосоме узнавать его. Однако не известно, сам ли инициирующий колон узнается малой субчастицей в этой реакции. При связывании с мРНК 408-субчастица экранирует область размером до б0 оснований.
Когда 608-субчастипа присоединяешься к комплексу, размеры защищенной области несколько сокращаются. Участок прочного связывания для 808-рибосом, как и у прокариот, захватывает область размером в 30-40 оснований. Кодон А(3О обычно располагается в центре этого отрезка. Уменьшение размеров экранируемой области, 808-рибосомами можно объяснить конформационными изменениями в малой субчастице, возникающими при ее взаимодействии с большой субчастицей.
С другой стороны, это может быть связано с потерей факторов инициации, способных самостоятельно экранировать некоторую область мРНК. Сравнение Зсконцевой последовательности рРНК у прокариот и эукариот показывает, что эта последовательность высококонсервагивна (рнс. 9.10).
В последовательности из 20 нуклеотидов, расположенной па отрезке между соседними дважды метилированными аденинами и 3'-концом, имеется только два значительных различия. У бактерий в определенном положении имеется два остатка 13, тогда как у высших эукариот здесь же находятся два остатка А (в случае низших эукариот обнаруживается промежуточная по составу нуклеотидов последовательность А13).
Кроме того, у всех эукариот обнаруживается делеция последовательности СС1)СС длиной пять пар оснований, которая и является областью, комплементарной последовательности Шайаа — Дальгарно. (Это означает, что если связывание с последовательностью Шайна — Дальгарно необходимо для инициации, то эукариотические рибосомы не способны инициировать трансляцию на бактериалъных мРНК). Внутри высококонсервативной 3'-концевой области (имеющейся как в бактериальной, так и в эукариотической рР11К) находится последовательность, обо| ащенная пуринами, 3'..
Л)АООААООСО13... 5', которая у эукариот удалена от 3'-конца приблизительно на то же расстояние, что и последовательность СС1)СС 126 Часть Н. Синтез белков ссоод пп д ос д о о д дсддпо 155-РРНК миеиеиитие аии 155 рРНК нектар й Рнс. 9.9. На 3'-конце рРНК может быть образована структура типа «шпильки» и результате спаривания комплементарных оснований у бактерий. С другой стороны, эта последовательность может принимать участие в образовании шпильки, хак показано на рис. 9.9. Некоторые эукариотические мРНК содержат четырех- или пятичленные последовательности нуклеотидов, теоретически способные образовывать пары с этой частью Зоконцевой последовательности рРНК (прн условии, что шпилька в рРНК разрушена).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
