Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 50

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 50)

С помощью тако! о подхода без непосредственного исследования бактериальной мРНК была создана подробная картина строения и функционирования этих молекул. Удобным исключением с точки зрения выделения мРНК является фаговая инфекция. В ряде случаев мРНК более стабильна в клетках, инфицированных фатом, чем в интактной бактерии-хозяине, что дает возможность физически охарактеризовать эту молекулу.

Превосходный образец для таких исследований представляют РНК-содержащие фаги, у которых мРНК служит и геномом и поэтому стабильна и может быть получена в больших количествах. Важным подходом к непосредственному исследованию бактериальной мРНК является использование бесклеточной системы транскрипции и трансляции. При наличии подходящей матрицы мРНК может быть синтезирована ш ч(гго. В качестве такой матрицы обычно используют клоиированную копию гена.

В присутствии рибосом Е. со!1, набора аминоацил-тРНК и прочих необходимых компонентов синтезированную мРНК можно транслировать в белковый продукт. Таким образом, можно исследовать и структуру, и функцию мРНК. Бактериальные мРНК значительно различаются по количеству кодируемых ими белков. Некоторые молекулы соответствуют только одному гену — это моиоци- мором 12000 п.н Ес зкспрсссик начинается н момсвт времени О. Длн простогм траискрипциониан сдкницз изображена так, как будто оиа со- держит один гон. строииые мРНК.

Другие (таких большинство) содержат последовательности, кодирующие несколько белков,- это полицистроиные мРНК. В этом случае единая мРНК транскрибируется с группы генов, расположенных рядом (как мы увидим в гл. !4, такой кластер генов представляет оперои, который контролируется как единая генетическая единица).

В составе всех мРНК можно выделить участки двух типов. Кодируюшии участок состоит из набора кодонов, соответствующих аминокислотной последовательности белка; он начинается обычно с кодона А(ЗП и заканчивается терминирующим кодоном. Но мРНК всегда оказывается длиннее, чем кодирующий участок. В моноцистронной мРНК на обоих концах могут находиться дополнительные участки.

Дополнительная последовательность иа 5'-конце, предшествующая началу кодирующего участка, называется лидериой. Дополнительная последовательность, следующая за терминирующим сигналом и образующая 3'-конец, обозначается как когщевая (трейлер). Несмотря на то что эти последовательности входят в состав транскрипционной единицы, они не используются для кодирования белков. На рис.

9.2 изображена структура полицистронной мРНК. Межпистроииые области, располагающиеся между разными кодирующими участками, значительно различаются по размеру. В случае фаговых РНК опи могут быть достаточно протяженными, достигая примерно 100 оснований. В некоторых бактериальных мРНК они состоят из нескольких (до 30) нуклеотидов, но возможно существование еще более коротких последовательно- 118 Часть 11. Синтез белков Межцнстроннея Концшая шклеюнетеньнасть дпя РНКаолнмерею~ Лнлернмт шюпецонетельность псспедонетельнссть Иннцинруюшнй кодируюсмй ТеРмин Руютцнй нннцнируюшнй коянруюшнн терм пирующий каюк дпн рибосомм уюсток кодаи дпя онбос*мь кадая дпн участок кодаи нпя рнбосамь рнгюсомм Рнс.

9.2. В состав бактериальной мРНК входят как истрансли- руемая, так и транслируемая области. Каждая колирующея область обладает своим собстненным инициирую- отей — вплоть до 1 или 2 нуьлеотидов, разделяющих терминируюший кодаи одного гена от инициирующего кодона следующего. В крайнем случае послеловательности двух генов могут практически перекрываться таким образом, что последнее основание терминируюшего колона )ЗОА в конце одного кодирующего участка является одновременно первым основанием инициирующего кодона А1)О в начале следующего гена.

Трансляция полицистронной мРНК Различные кодируюшие участки полицистронной мРНК транслируются независимо или же согласованно? Одинаков механизм инициации для всех цистронов нли различен„или же инициация первого цистрона отличается от инициации остальных цистронов? В случае полицистронных бактериальных мРНК очередность собыгнй показывает, что трансляция должна происходить последовательно-цистрон за цистроном. В тот момент, когда рибосомы прикрепляются к первому кодирующему участку, последующая кодирующая область, возможно, еще даже не транскрибировалась. К тому времени, когда второй сайт, связывающий рибосомы, только становится доступным, в первом цистроне трансляпия уже достигает значительных размеров.

Но что же происходит в межцистронных областях? Это пока еше окончательно не выяснено; возможно, это зависит от конкретной мРНК. Вероятно, в большинстве случаев взаимодействие рнбосом с началом каждого цистрона происходит независимо друг от друга. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что инициация внутренних цистронов также чувствительна к касугамицину (специфическому ингибитору инициации), как и инициация первого цистрона.

В верхней части рис. 9.3 показан наиболее вероятный ход событий. Трансляция первого цистрона заканчивается обычным образом; при этом рибосомы диссоциируют па субчастицы и покидают мРНК. Затем новая 308-субчастица должна прикрепиться к следующему инициирующему кодону, соединиться с 508-субчастнцей и начать трансляцию следующего цистрона. Но эта последовательность событий не говорит о том, что трансляция первого цистрона никак не может влиять щим и герминирующим сигналами. Обьтнио мРНК может содсржнть не- сколько «олирующих аблнстсй на трансляцию следующего за ним цистрона. Известны случаи, когда мутация в одном гене предотвращает экспрессию другого гена, расположенного за ним в составе той:ке полицнстронной мРНК.

Это явление получило название эффект полярности. Его основная причина заключается в опосредованном действии мутации на травскрипцию, которая прекращается вскоре после участка, несущего полярную мутацию (см. гл. 13). Однако полярность также может возникать в результате взаимосвязанной трансляции двух цистронов, входящих в состав одной мРНК, Одна из форм такой взаимосвязи может наблюдаться, когда промежуток между кодирукшзими последовательностями достаточно мал. Находясь на мРНК, рибосома экранирует около 35 оснований; следовательно, она одновременно может взаимодействовать с терминнрующим кодоном и следующим за ним инициируюшим кодовом, если они разделены несколькими основаниями.

Конечно, такое взаимодействие практически всегда встречается в случае непосредственно соседствующих или перекрывающихся нуклеотидных последовательностей. Такое перекрывание позволяет не замечать некоторые обычно встречающиеся межцистронные сигналы. Например, 308-субчастица терминирующей рибосомы может не отделиться от мРНК. С большой вероятностью она останется прикрепленной к матрице, так как фактически присоединение к иннцинрующему сайту уже произошло. Как показано в нижней части рис.

9.3, это означает, что 508- субчастица и образовавшаяся полипептидная цепь освободятся, а 308-субчастица должна остаться на месте для реинициирования трансляции следующего цистрона. Не исключено, что существуют ситуации, при которых вся 708-рибосома остается связанной с матрицей, хотя, по-видимому, это менее вероятно. Другой внд взаимосвязи между цистронамн в полнцистронной мРНК опосредован вторичной структурой молекулы.

В бактериальной мРНК такая ситуадия обычно не встречается, так как рнбосомы следуют сразу за РНК- полимеразой и поэтому в области, разделяющей их, комплементарные основания не могут образовать стабильный двухцепочечный участок. Однако, когда рибосомы отделяются от мРНК, дойдя до нонсенс-кодона, расположенного в начале цистрона, последующая 9. Информационная РНК как матрица для синтеза белка 119 Рис. 9.3. Способ реиницнацин внутри цолнцистронных мРНК может зависеть от размеров межцистронных областей.

Вверху Котла межцистронные промежутки длиннее. чем область, кон- зактирующая с рибосомой, за диссоциацией на концевом сайте независи- область мРНК может сформировать вторичную структуру. Поэтому комплементарное взаимодействие какой-либо области с инициирующим кодоном может препятствовать его связыванию с 308-субчастицей. Возможно, такой механизм обусловливает полярность на уровне трансляции. Явление той же природы обычно обнаруживается при трансляции фаговых РНК, цистроны которых всегда экспрессируются в определенной последовательности. Причина состоит в том, что фаговая РНК обладает вторичной структурой, позволяющей только одной инициирующей последовательности взаимодействовать с рибосомой.

Рибосомы не могут присоединиться к остальным инициирующим последовательностям, так как те образуют пары с другими участками РНК. Однако в процессе трансляции первого цистрона происходит разрушение вторичной структуры, что позволяет рибосомам присоединиться к инициирующему кодону следующего цистрона. Таким образом, в этой мРНК вторичная структура контролирует способность определенных цистронов транслироваться. Число рибосом, принимауощих участие в трансляции определенной мРНК в какой-либо момент времени, зависит от эффективности узнавания инициирующих последовательностей. В случае трнптофановых генов Е.

Характеристики

Список файлов книги