Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Об этом будет рассказано ниже. Участки рРНК, связывающие эти белки, могут быть охарахтеризованы путем выделения фрагментов нуклеиновой кислоты, защищенных от расщепления нуклеазами. Таким путем была построена карта, показывающая расположение участков связывания рибосомных белков на рРНК. Как видно из рнс. 8.9, Рнс. 8.8. Во вторичной структуре прокарнотической 55-РНК имеется 4 спиральных участка, тогда как эукариотичеекая 55-РНК образует 5 спиральных участков. гс Модель бактериальной (Б. «ой) 5ВРНК Б Модель оукаркотнчеокой (СЫ«тела) 58-РНК Рнс. 89. Участки связывания рнбосомных белков сгруппиро- ваны ближе к 5сколпу 1бб-рРНК. в случае !бЯ-рРНК места связывания сгруппированы преимущественно на 5сконце рРНК.
Можно было думать, что остальные белки непосредственно не связаны с РНК, но оказалось, что полученный результат обусловлен самим способом выделения рРНК. В дальнейшем было показано, что, используя различные методы выделения.
можно выявить еще ряд белков, способных достаточно прочно связываться с рРНК. Из этого следует, что конформация рРНК (которая зависит от метода выделения) непосредственно определяет возможность существования участков связывания для некоторых белков. По мере связывания определенных групп белков происходят конформационныс изменения в рРНК, сказы- 8. Рибосомы как фабрики белкового синтеза 109 Збб ютбчастина е Присоединение допслнителенмк р босомообраатющ т4,! белкаа ! ! С!01 1 1 1 ! 1 ! 1 1 эдтд !! 1 1 1 1 21$ "юстина, илий\ Дололнителн ма 230-рибоРибоотмссбраатюстие н1тклеолрота белки ности часика настина ~ 40'С моста 1ос Стртктурнме банк» 105 РРНК вающиеся на последующем взаимодействии с белками, которые до этого не были способны прикрепиться к рРНК. Для участков связывания, обнаруженных на рРНК, характерно наличие вторичной структуры, часто имеющей форму шпилек, чьи двухпепочечные стебли содержат неспаренные области.
В отношении 308-субчастнцы Е со11 установлено, что почти все или даже просто все рибосомные белки способны связываться с ! бЯ-рРНК, хотя н в различной степени. Прн исследовании 50$-субчастнцы получены сходные результаты, но в данном случае ситуация изучена менее детально. Диссоциация и реконструкция рибосомнв!х субчастиц При центрифугировапии рибосомных субчастиц в градиенте плотности СзС! от каждой субчастицы отделяется определенная группа белков (дополнительные рнбосомообразующие белки). При этом из 308- и 508-субчастиц образуются соответственно 238- и 428-рибонуклеопротеиновые частицы.
Прн обработке рибосом возрастантщими концентрациями СзС! или Е1С! происходит ступенчатая диссоциация определенных белков. Из этого можно сделать вывод о том, что в составе рибосомы имеются группы белков, взаимодействующих кооперативно. В результате диссоциация одного нз членов группы вызывает днссоциацию остальных. Реконструированные субчастицы обладают функциональной активностью. Оптимальные условия самосборки, первоначально разработанные для ЗОБ-субчастиц Е. со(0 сейчас используются применительно и к 508-субчастицам.
Процесс протекает (и рйго и состоит из двух стадий, одна нз которых характеризуется температурозависимой реорганизацией частиц. Это схематично показано на рис. 8.10. На первой стадии самосборки 308-субчастиц происходит объединение (бя-рРНК с группой нз ! 5 белков. Эта стадия протекает прн пониженной температуре и приводит к образованию к1-частиьь Перед тем как произойдет присоединение остальных 6 белков, К1-частицы необходимо прогреть. При этом происходит молекулярная перестройка, приводящая к образованию )с1е-настин. На природу такой перестройки цролнвает свет действие ЭДТА ца 308-субчастицы.
Это хелатообразующее соединение связывает ионы магния, вызывая тем самым развертывание субчастицы и диссоциацию ряда белков. Получающиеся частицы сходны с К1-частицами в том отношении, что они не способны снова присоединять недостающие белки с образованием функционально активных субчастиц до тех пор, пока не будут прогреты. Таким образом, лимитирующим этапом при самосборке, очевидно, является температурозависимая перестройка, приводящая к более компактной ор~анизации формирующейся частицы.
Мутации, влияющие на самосборку рибосомы Поскольку при реконструкции !и тйго рибосомные субчастицы необходимо инкубировать при повышенной температуре, очевидно, что можно получить холодочувствительные мутации, нарушающие процесс самосборки, Такие мутации отбирают среди бактериальных клеток, в которых синтез белка протекает нормально прн обычной температуре, но прекращается при пониженной тем- пературе, так как при этом не могут образовываться полноценные рибосомы. Используя такой подход, Номура ()чощпга) и его сотрудники выделили несколько типов за!1-мутаций (нарушающих сборку субчастнц).
Оказалось, что ряд мутаций, полученных ранее на основе других свойств (таких, как устойчивость к антибиотикам, взаимодействующим с рибосомой), также обладают подобными свойствамн. Если инкубацию бактериальных клеток, содержащих такие мутации, проводят прн пониженной температуре. образование функционально-активных субчастиц прекращается. Некоторые мутации вызывают изменения в определенных рибосомных белках; другие могут локализоваться в генах, продукты которых какнм-то образом влияют на процесс самосборки.
Прн наличии хит(-мутаций в клетке накапливаются частицы, которые по размеру меньше, чем функционально активные рибосомные субчастицы, и являются их предшественниками. Такие промежуточные частицы содержат рРНК, соединенную с некоторыми, но не со всеми белками, вхолящими в состав субчастиц. В каждом случае отсутствие конкретного белка блокирует самосборку на определенной стадии. Для каждой субчастнцы охарактеризованы основные промежуточные продукты, образующиеся ш Иро.
В случае 508-субчастицы предшественниками являются частицы с коэффициентами седиментацин 43$ и 328, содержащие 238-рРНК и некоторые из белков, входящих в состав 508-субчасгицы. 32$-частица — первый промежуточный продукт, идентифицируемый при самосборке. 438-час!ица представляет собой структуру, образую!цуюся на последующей стадии; она содержит все белки, входящие в состав 328-частицы, а также несколько других белков. В случае 308-субчастицы обнаружены предшественники, обладающие в зависимости от условий выделения коэффициентом селиментацин 2бЬ или 2)Я.
Они также Рнс. К10 305-субчастяцы мотУт быть лнссоцияроваяы на более мелкие частицы, из которых прн самосборкс обррзуютср цромс- жуточные комплексы. Часть 11. Синтез белков 110 тельно связаться с !6Я-РНК, для того чтобы определенный белок мог быль вовлечен в самосборку. Установлено, что рибосомные белки должны присоединяться к формирующейся частице в определенной последовательности. Некоторые белки, характеризуюшиеся по данным, приведенным на рис. 8.!2, тесной взаимосвязью при самосборке, действительно располагаются рядом.
Это соответствует представлению о том, что последовательность самосборки во многом определяется непосредственными физическими взаимодействиями. Разумеется, пока еше многое в процессе самосборки нам неясно. Так, присоединение одного белка может в принципе привести к формированию участка связывания для другого белка в любом ином участке рРНК. Все белки, необходимые для самосборки, располагаются в «ранней» части карты, т.е. связываются с рРНК первыми. Функцию некоторых белков можно определить, проводя самосборку в их отсутствие.
Очевидно, что этот прием можно использовать только в отношении белков, участвующих в завершающих стадиях самосборки, а не тех, которые определяют возможность связывания других белков. Таким образом, было установлено, что определенные белки 308-субчастицы принимают участие в определенных стадиях белкового синтеза, так как сформировавшиеся частицы были лишены некоторых ферментативных активностей. В составе 508-субчастицы имеется белок 1.24. Он одним из первых включается в состав первого предшественника и прочно удерживается, связываясь с несколькими участками, находящимися на 5'-конце РРНК. Этот белок можно отделить от субчастицы в присутствии 1лС1. При этом субчастицы, лишенные 1.24, полностью сохраняют активность при синтезе белка.
Из этого следует, что 1.24 необходим для пропесса самосборки, но не играет никакой роли в последующем функционировании рибосомы. Сборка 308-субчастиц, вероятно, начинается еще во время транскрипции рРНК. Этим, возможно, и объясняется тот факт, что наибольшее число участков, прочно связывающих белки, находятся на 5сконце транскрипта, образующегося первым.
Вероятно, что в процессе разрезания предшественника освобождается рРНК, уже связанная с рядом рибосомных белков (рис. 8.13). Далее белки продолжают присоединяться к РРНК в последовательности, определяемой процессом самосборки. Единственный промежуточный рибонуклеопротеин, который можно выделить„представляет собой отдельную частицу, содержашую большинство белков.
Мы уже упоминали, что в состав такой частицы входит 165-РНК, представленная незрелой формой, имеющей несколько дополнительных нуклеотндов. На этой стадии рРНК метилирована только частично. Вероятно, конформациониые изменения рРНК сопряжены с удалением дополнительных последовательностей и с метилированием; только после этого оставшиеся белки могут войти в со- Озл Яв®ЯОз1ь ьа!з)Сз!е)Я Я® 84Сза)ССззас)ЯССзз1ь)(й~)Сз«ь 1з|э)Озз Сз1э)Озь ~~йа Озы ($4)Сза) Сзэл!Озьь ЯОзп ®Я Я®Оззо ЩЯЩзЯЯ ЯОзь $)вв)Озп Озь Белки меюьь«»» ь с»ставь Эж нь ы и авлкв пр»сжствующив ь «» зве Н1«а»««ь оьрзз»ющи«ь» п ьно кепки, еюь»днмые л»ь свм»сборки н то Бе»к, кОторые не удал юн »риоь»«янке с ылос~ были охарактеризованы как минорные промежуточные компоненты„образующиеся при формировании рибосом в бактериях дикого типа.
Порядок самосборки определяется пространственной организацией субчастиц Как видно из рис. 8.!О, в случае малой субчастицы предшественник, обиаруживаемый !и И»о, и й1-частицьь реконструированные !и си!го, содержат очень похожие или даже одинаковые наборы белков. При сравнении же РНК этих частиц выявляются некоторые различия. В состав предшественника, обнаруживаемого !и к!яо, входит более длинная рибосомная РНК, тогда как частицы, сформированные !и И!го, содержат зрелую 16$-РНК. Тот факт, что зрелая рРНК может быть использована для самосборки, заслуживает особого внимания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
