Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Из данных, приведенных на рис. 8.11, видно, что белки, входящие в предшественники и в й1-частицы, также , имеют много общего с белками, которые в присутствии !лС! или СзС! диссоциируют в последнюю очередь. Следовательно, можно предположить, что пространственная организация 308-субчастицы отражает процесс ее самосборки. Те белки, которые входят в состав предшественника (сюда относятся все белки, наиболее прочно связанные с рРНК), как правило, являются самыми постоянными компонентами 30$-субчастиц и с трудом отделяются от рРНК даже при жестких условиях обработки.
Роль конкретного белка в процессе самосборки рибосомной субчастицы возможно проанализировать, если попытаться осуществить реконструкцию рибосомы в отсутствие этого белка. Таким путем было установлено, что при исключении некоторых белков из реакционной смеси процесс полностью прекращается. Следовательно, именно эти белки необходимы для самосборки. Другие белки необязательны; субчастицы, образующиеся в их отсутствие, по физическим параметрам могут быль нормальными, но по их способности осуществлять синтез белка они оказываются дефектными по ряду функций. Влияет ли отсутствие одного белка на способность других белков к самосборке? Для изучения этого вопроса используется частичная реконструкция.
В этом случае необходимо устранить из среды определенный белок, а затем проследить, будут ли оставшиеся белки способны формировать частицы. Такой подход возможно осуществить независимо от того, образуется ли в результате частичной самосборки функционально активная или неактивная частица. Последовательность самосборки ш чйго, изображенная на рис. 8.12, была установлена в результате опытов, в которых исследовалось, какие белки должны предвари- Белки, »села Д54 Сза)(з20)Д57 Сз15)Д513 Сз!э Рис. 8.!! Схожие наборы рибосомных белков входят в состав промежуточных частиц, образующихся в результате самосборки как !и вко, так и !а тно, а также в состав рибонуклеовротеяновых частиц.
Белки, присуж1»Х«ньз»ь во ьеех случаях, обозначены затемненными кружками: ж кь, которые встречаются нь всегда,— светлыми кружками. В. Рибосомъг как фабрики белкового синтеза нк Белки У рибааамнык белков ааннанезан назиажнаазь свазыйззьж а 155.РРНК, кзн только анз нзчннзез трзнакрнбнрааазьар Рнгюаамнзн РРНК аазабаэшвзюн а киде дзнннауа арадшзаззен нкз п1Б, ка арый азнэзн ар баизнуеаьна а ааааа йай аазк бзрчаа Шя.аубчмшч, аынмазюш х канфармзкначиую ачрзазрайку; а аааюаз 215.застичь| аззазнь мезнанраззниз РРНК шюззэзааз \Π— 20% Оаззашнаа барки азайрз э аашвэ чзазююь избыючнз ааарайаазтвньчаазь РРНК атщзараезан и рранахаднт ачаючзнчз ааззюшимй мззнльчых Груза став частиц.
!и уйго не удается метнлировать свободные )бя-рРНК, но промежуточные рнбонуклеопротеиновые частицы служат субстратом для метилаз, что согласуется с рассмотренными выше представлениями. Мутационные изменения могут затрагивать все компоненты рибосомы Поскольку рибосомы играют центральную роль в жизни клетки, для получения мутантов по каждому из компонентов рибосом понадобилось много времени. Но сейчас уже удалось получить мутации почти для каждого рибосомного белка, что дало возможность картировать соответствующие гены в хромосоме.
Некоторые мутации были выделены по их способности подавлять в небольшой степени синтез белка, но мутации по другим белкам удалось получить только в виде условно летальных (гл. 2). Механизм действия некоторых антибиотиков состоит в блокировании синтеза белка. Можно выделить мутантов, устойчивых к таким антибиотикам. Во многих случаях зти мутации вызывают изменения рибосомных белков (илн ферментов, принимающих участие в синтезе белка). Устойчивость к антибиотикам обусловлена мутациями, затрагивающими 5 белков 30э-субчастицы и 4 белка 50$-субчастнцы. Используя эти мутантные варианты, можно исследовать функцию данного белка в рибосоме. Непосредственные попытки выделить мутации, влияющие на синтез белка, были связаны с опытами по получению изменений, сказывающихся на точности работы белоксинтезирующего аппарата.
Если в каком-нибудь гене, кодирующем белок, возникла мутация, она может быть супрессирована (как об этом уже говорилось в гл. 7) мутацией в гене, детерминирующем структуру тРНК; другой тип супрессии возникает в результате рибосомных мутаций. Был выделен ряд рибосомных мутаций, вызывающих реверсию первичных мутаций в различных генах. Иногда при этом мутация затрагивает какой-либо из известных этапов трансляции-тогда удается выяснить роль конкретного белка в исследуемом процессе.
Таким образом, были получены мутации в генах, кодирующих шесть рибосомных белков. Мы уже отмечали, что могут бьшь получены холодочувствительные мутации, влияющие на сборку рибосом. Такой же фенотнц свойствен некоторым мутантам, устойчивым к антибиотикам. Таким образом, было установлено, что четыре белка 30$-субчастицы н один белок 505-субчастицы принимают участие в самосборке рибосом. Поскольку в отсутствие рибосом клетка погибает, данный вид мутаций является условно-летальным. Ряд рибосомных белков был идентифицирован благодаря изменениям в их структуре у температурочувствительных мутантов.
Температурочувствнтельные мутации приводят к тому, что при повышенной температуре рост бактерий замедляется — эффект, обусловленный каким-то повреждением в рибосомном белке, функция которого при непермиссивной температуре, по-видимому, нарушается. Общий характер таких мутаций не дает ключа к выяснению и функции данного белка. Все же остается еще несколько рибосомных белков, в генах которых не удалось получить мутаций. Это, возможно, связано с тем, что данные белки не являются обязательными для сборки и функционирования рибосом. Рнс. 8Л 2. Самосборка рнбоеом включает ряп последовательных реакций. Стрелки между белками пакйзырнюу, чта олин белок сцасабаззуаг дрнсаадннанню другого !базак, нз катарый направлена сзрадкн ма:кау сэйзйтьсй а частицей ганька н присутствии цзр1нарз, ат которого идет эзз стрелка, двойные стрелки азнэчзюг, чта эффакт нззнмнын) Жнрнымн азрадкзмн накзззна андьна эырэжаннзн эзэнснмоать, к тонкими -слабая зйэнснмаать.
Если дзй белка оказывают назээнснмаа действие нэ какой- либо другой белок, та эзаз эффект обозначается индивидуальными сградкйьзн; когда жа эффакз кэдйагсз кааперзтнзныьк уа используется абьаднчаннкн страдкк Страйкзмн, ндушнмн ат РНК, указаны белки, нацбанка карашо анйзыкйюшнаск с РРНК; однако другие белки также могут с ней взаимодействовать. Белки, рзацадожанныа ближе ранга к рРНК, встречаются з частицахнрадшасуэанннкйк наиболее часта; белки, распадажанныа нз схеме дальше ат РНК, участвуют з акмасбарка нк базар поздних стадиях н днссоцннруют прн бодра ннзкнк концангрйцннк соли Пунктирная линия атдсдэат белки, часто эазрачаюшнесэ э частицах-предшественниках, от зак, «атарыа ннкагдй э ннк на обнаруживаются. Этк наадеднйй группа белков зккнэздантнз данадннтадьным рнбасамаобрзэуюшнм белкам.
Рнс. 8.13. Самосборка рнбосомной субчастнцы является цосде- дондтельным процессом, н котором присоединение кажлого бен- ка нызынает конформацнонные перестройки. 112 Часть П. Синтез белков Обычно мутации, затрагиваюшие бактериальные рибосомы, обнаруживаются в результате образования измененных белков. В ряде случаев (пока что в шести) исследуемый геи, возможно, дслетирован.
Рибосомы таких мутантов особенно полезны при изучении вопроса о необходимости данно~о белка для функционирования рибосомы. Путем выявления мутантных белков по их электрофоретичсской полвижности были выделены мутации, затрагивающие все рибосомные белки. В случае этих мутаций осталось неизвестным, влияют ли мутации на функцию рибосомного белка.
Исследуя мутантов, устойчивых к касугамицину, удалось показать, что 168-рРНК принимает непосредственное участие в белковом синтезе. Касугамицин блокирует инициирование трансляции. Мутанты, устойчивые к этому антибиотику и относяшиеся к типу КхдА, лишены метилазы, обеспечиваюшей присоединение четырех метильных групп к двум соседним адеиинам. расположенным недалеко от 3'-конца 16$-рРНК. При этом образуется высококонсервативная последовательность О-гпххА-гпьхА, обнаруживающаяся как в эукариотических, так и в прокариотических 168-рРНК.
Из этого слелует, что наличие четырех метильиых групп в 16$-рРНК рибосом дикого типа делает их чувствительными к действию касугамицина. Почему же отсутствие метильных групп придает устойчивость к этому препарату? ЗОБ-субчастицы как дикого, так и мутантного типов одинаково чувствительны к ингибирующему действию касугамицина, которое состоит в нарушении связывания ГМег-тРНКь Но в присутствии 50$-субчастицы 1Мег-тРНКг освобождается из чувствительных (дикий тип) к действию антибиотика рибосом, тогда как в мутантных рибосомах эта тРНК сохраняется, что позволяет продолжить синтез белка.
Следовательно, можно предположить, что метильные группы участвуют во взаимодействии 308- и 50$-субчастиц, а также в удержании инициаторной тРНК. О влиянии большой субчастицы на этот процесс свидетельствует тот факт, что мутации по белку 508-субчастицы приводят к зависимости рибосомы от касугамицина. Такие мутации картируются в генах, кодируюших некоторые белки 50$-субчастиц. Другим указанием на важное значение 3'-конца 16$-рРНК является чувствительность белкового синтеза к колицину ЕЗ. Этот белок продуцируется некоторыми бактериями и разрезает 16$-РНК Е. сой на расстоянии около 50 нуклеотгщов от ее 3'-конца.
В результате нарушается инициация белкового синтеза. Некоторыс мутационные изменения большой рРНК митохондриальных рибосом придают устойчивость к хлорамфениколу. Этот антибиотик останавливает синтез белка. осуществляемый бактериальиыми и митохондриальными рибосомами, блокируя пептидилтрансферазную реакцию. При этом у бактериальных мутантов, устойчивых к хлорамфениколу, изменены белки 50$-субчастицы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
