Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 51
Текст из файла (страница 51)
сой, кинетика экспрессии которых изучена хорошо, как правило, в каждый момент времени около !5 молекул РНК-полимеразы находится на транскрипционнои единице, состоящей из 7000 пар оснований. С момента транскрипции до момента деградации каждую мРНК, вероятно, успевают протранслировать около 30 рибосом. Поэтому, если каждую минуту происходят пять актов инициирования транскрипции, то это позволяет в данный промежуток времени сиптезироваться около 150 молекулам белка, при условии что клетка находится в стационарной фазе роста. С помощью электронной микроскопии в клетках Е сод были обнаружены транскрипционные единицы, изображенные на рис. 9.4.
Видно, что 'одновременно синтезируется несколько молекул мРНК, к которым прикреплены транслирующие рибосомы. мо происходит инициация на следующем цистроне. Внизу. Если межцн- стронные промежутки короткие, ЗОЗ-субчастнца может отделяться на короткое время или даже остается связанной с мРНК в процессе терми- нации и реинициации Функциональное определение эукариотической МРНК Полирибосомы представляют стабильную фракцию эукариотической цитоплазмы, и их можно выделить при центрифугировании клеточных компонентов.
Но поскольку на долю мРНК приходится лишь незначительная часть от общей массы РНК, входящей в полирибосомную фракцию (основное количество представлено рибосомной РНК), го ее нельзя выделить, используя только стандартные приемы фракционирования, Попытки избирательно пометить мРНК с помощью радиоактивных предшественников нуклеотидов (подход, использованный применительно к бактериям) не увенчались успехом, так как при этом одновременно метились некоторые виды цитоплазматических РНК, включающие метку так же быстро и эффективно. Все это привело к тому, что выделение эукариотических мРНК было осуществлено позднее, чем выделение бактериальных мРНК.
В основе первого методического приема, позволившего отделить мРНК от других видов РНК, лежала обработка полисом хелатообразующим агентом ЭДТА. Основной эффект этого соединения состоит в связывании ионов Мйз+ и в удалении их из состава рибосом. Это вызывает диссоциацию полисом на отдельные рибосомы.
В результате освобождается мРНК, которая обнаруживается во фракции с коэффициентом седиментации около !8$. При этом мРНК ассоциирована с белками и находится в форме рибонуклеопротеиновых частиц (мРНП). Загрязняющий рибонуклеопротеиновый материал, не участвующий в трансляции, не разрушается в присутствии ЭДТА и поэтому по-прежнему седиментирует быстро с коэффициентом седиментации около 200$.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые с тех пор, эта методика по-прежнему имеет большое значение по двум причинам. Во-первых, это функциональный тест, позволяющий идентифицировать мРНК, непосредственно транслируемую рибосомами. Поэтому обнаружение мРНК в этой фракции может рассматриваться как дока- Часть 11. Синтез белков 120 йв Рис.
9.4 У бактерий визуально можно наблюдать тра»скрип цию, сопряженную с трансляцией. ДНК выглядит в виде тонкой лииии, проходящей в цеитре снимка. Отхо дягпие от пее нити зто транелируемые молекулы мРНК. Приблизитель зательство того, что она на самом деле используется для синтеза белка в тех клетках, из которых была выделена. Во-вторых, эта методика, вероятно, позволяет получить мРНК в ее наиболее естественной форме в виде рибонуклеопротеиновых частиц.
Как правило, лишь очень небольшое число белков обнаруживается в составе мРНП. В клетках млекопитающих почти во всех исследованных случаях было обнаружено два основных белка с мол, массой около 52000 и 78 000 дальтон. Обычно не более двух или трех других белков присутствует в таких же количествах. Остальные белки являются минорными компонентами. В наиболее хорошо изученном случае глобиновой мРНК, полученной из эритроцитов, количество белков с молекулярной массой 52000 и 78 000 составляет от одного до двух на каждую молекулу мРНК, Функциональная значимость этих белков непонятна Они могут принимать участие в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму или же оказывать влияние на их трансляцию. Сопутствующая рибонуклеопротеиновая фракция рассматривается как «загрязняющая» только в том смысле, что она является нежелательным компонентом при выделении полисомной фракции.
В действительности РНП, вероятно, представляют собою полноценные клеточные компоненты. Молекулы РНК, входящие в состав этой фракции, обладают свойствами, ва многом характерными для мРНК. Но при этом данные молекулы РНК, полученные прн обработке РНП частицы ЭДТА, не участвуют в трансляции. Их взаимосвязь с мРНП неясна, но, возможно, они содержат истинные молекулы мРНК (неактивные в данный момент), которые будут вовлечены в трансляцию на более поздних стадиях или з ри изменившихся условиях. Некоторые эмбриональные клетки содержат «запасенные» молекулы мРНК. Они сушествунтт в виде рибонуклеопротеиновых частиц, не принимающих участия в трансляции.
Но содержащаяси в этих частицах мРНК непосредственно используется для синтеза белка на более поздних стадиях эмбриогенеза. Хотя мы и не знаем, встречается ли аналогичный способ сохранения мРНК в дифференцированных клетках, тем не менее сейчас довольно точно установлено (особенно в, случае морских организмов), что значительная часть новообразованной мРНК, синтезированной на ранних стадиях эмбриогенеза, „т-.. а по !5 молекул лгРНК синтезируются ив одной единице зраискрплции. По мере продвижения слева направо, по иапрввлеиию синтеза, возрастает гииив образуюшикся молекул Каждая РНК покрыта рибосомвми.
(Фотография дюбезио предоставлена Озсвг Мгйег! не транслируется сразу же, а запасается для использовании на более поздних сгадиих. Информационная РНК в цитоплазме эукариот относительно стабильна. При измерении ее стабильности обнаруживается несколько дискретных компонентов. Обычно около половины мРНК в культуре клеток млекопитающих имеет период полужизни около 6 ч, тогда как оставшаяся мРНК характеризуется стабильностью, соизмеримой с продолжительностью клеточного цикла, составляющей 24 ч. В дифференцированных клетках, специализированных на синтезе определенных белков, некоторые мРНК могут быль еще более стабнлъными.
3'-конец эукариотических МРНК может быть полиаценилирован Большинство эукариотических мРНК содержат на 3'-конце последовательность из полиаденнловой кислоты. Этот концевой участок из остатков Л принято обозначать как ро1у(А)-конец, а мРНК, имеющую такую структуру, как ро)у(А)+. Ро!у(А)-последовательность не закодирована в ДНК; она присоединяется к РНК после того, как произойдет транскрипция в ядре. Присоединение ро1у(А) катализируется специальным ферментом ро1у(А)-полнмеразой, узнающей свободный 3'-ОН копен мРНК и добавляющей к нему еще около 200 остатков А (как подробно изучено на клетках млекопитающих).
Этот добавляемый участок состоит исключительно из остатков А; каким образом контролируется его длина, к сожалению, пока не известно. Когда мРНК только поступает в цнтоплазму, ее ро!у(А)-конец имеет примерно ту же самую длину, что и в ядре. Однако полиаденилированный конец постоянно укорачивается, возможно отдельными частями, в результате эндонуклеолитических разрывов. Таким образом, клеточная популяция мРНК содержит как «новые», так и «старые» молекулы, имеющие относительно длинные и более короткие ро1у(А)-участки. Однако длина ро!уА- конца в данной модекуле, по-видимому, не влияет ни на ее способность к трансляции, ни на ее стабильность в цитоплазме.
Когда некоторые индивилуальные мРНК ннъецировались в овоциты Хепорцз 1аеик, было замечено, что ста- 9. Информационная РНК как матрица для синтеза белка 121 бильность этих молекул увеличивалась с длиною ро1у(А)-конца; однако в случае других мРНК такой корреляции не наблюдалось. В отношении аденовирусных мРНК бьио показано, что блокирование добавления к ннм ро!у(А) также уменьшает стабильность этих молекул в клетках-хозяевах.
В цитоплазме других клеток (не млекопитающих) протяженность ро!у(А)-участка может быть несколько короче, но в целом прослеживается та же закономерность: уменьшение длины ро!у(А) с «возрастом» молекулы. Ро!у(А) имеется в цитоплазматической РНК всех исследованных эукарнот, а также в митохондриальной. В мРНК клеток млекопитающих ро!у(А) ассоциирована с одним н эем же белком в 78000 дальтон, который является преобладающим компонентом мРНП. Из этого, очевидно, следует, что 3'-конец мРНК состоит из ро!у(Л)- участка, связанного примерно с равной массой белка (3ьконцевая локализация этого белка в мРНП объясняет, почему этот компонент не создает помех при трансляции рибосом).
После того как было обнаружено существование (А)- последовательностей, первоначально предполагали, что эта структура имеется во всех клеточных мРНК. Хотя ро!у(Л)-содержащая фракция мРНК всегда составляла менее !00%, это несоответствие, как правило, объясняли тем, что в процессе вьщелення происходит частичная деграцация.
Один-единственный разрыв в ро!у(А)-мРНК мог бы привести к образованию 5'-концевой части молекулы, не содержащей ро!у(А), и такие фрагменты могли бы ошибочно быть приняты за подлинные мРНК. Однако даже при самой тщательной методике вьщеления мРНК, при которой возможность разрывов сведена к минимуму, все же остается доля молекул, не содержащих ро1у(А). Обычно эта доля составляет одну треть от общего количества мРНК. Основной компонент этой ро1у(А) -фракции представлен молекулами гистоновых мРНК, кодирующих гистоновые белки хромосом. Этн мРНК имеют небольшие размеры и синтезируются только в определенные периоды клеточного цикла.
Остальная часть ро!у(А) -фракции (примерно две трети) идентична фракции ро!у(А)ч-молекул как по структурному, так и по функциональному параметрам, отличаясь от нее лишь отсутствием ро!у(А). Таким образом, по размерам, стабильности, эффективности трансляции, нуклеоцитоплазматическому транспорту и во всех остальных отношениях оказывается, что ро1у(А) -фракция не отличается от ро!у(А)+-мРНК.
Разные илн одинаковые белки кодируются ро1у(А) + - и ро!у(А) -мРНК? Гистоновьге мРНК специфичны для ро1у(А) -фракпии, поскольку ни одна из гистоновых мРНК обычно не обнаруживается в ро!у(А)'-фракции. Однако другие компоненты ро!у(А) -фракции значительно перекрываются с молекулами из ро1у(А)" -фракции. Возможно, что все эти мРНК также существуют и в полнаденилированной форме. Таким образом, отдельный ген может быть представлен в транскриптах, часть которых полиаденилирована, а часть — нет. Вероятно, сущесгвуют различия и в степени полиаденилирования каждой конкретной молекулы мРНК.
Однако в настоящее время пока еще трудно сделать какие-либо общие выводы о значении полиаденилирования (или же его отсутствия)..По-видимому, в некоторых случаях наличие ро!у(А) действительно влияет на стабильность мРНК; других эффектов пока не обнаружено. Выделение мРНК с использованием ро) у(А)-конца Основная часть «лещчной РНК лредставне а РРНК, не содермвщей Рец ГЫ мРНК, содернощан РОН!А)сюставлнет нейолмнтм часть стммарной клеточная РНк Ал РоЧ(АГА РНК свядиваенн юаня Растнотюм с ой нонной аллой Д Ал Рсижйа'НК Рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
