Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 52

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 52)

9.5. Ро!у(Л) т-РНК можно отделить от других видов РНК с помощью фракцнонировання на о118о(гГТ)-сефароэе. Присутствие ро!у(А) в молекулах мРНК имеет чрезвычайно важное практическое значение. Ро1у(А)-последовательность мРНК может комплементарно взаимодействовать с олиго (13) или олий о (г)Т); эта реакция используется для вьшеления ро1у(А)-мРНК. Наиболее удобным методом является иммобилизация олиго (() или г(Т) на твердом носителе, например путем химического присоединения к сефарозе. Когда популяцию молекул РНК пропускают через такую колонку, то задерживается только ро!у(А)+-фракция. Эта фракция может быть получена при обработке колонки раствором с низкой ионной силой, в котором разрушаются водородные связи и освобождается РНК, как зто схематически изображено на рис.

9.5. Единственный недостаток данного метода состоит в том, что прн этом выделяются все молекулы РНК, содержащие ро!у(А). Так, например, если используется суммарная клеточная РНК, то на колонке будет задерживаться как ядерная, так и цитоплазматическая ро1у(А)'- РНК. Если же используются полисомы (полученные по обычной методике), то большая часть выделенной ро!у(А) -РНК представляет собой трансляционно-активные мРНК; однако в эту фракцию попадут и некоторые молекулы РНК из РНП-частиц, обычно загрязняющие препараты полисом, и также содержащие ро!у(А).

Поэтому, когда важно вьщелить именно активную популяцию мРНК, необходимо применять обработку ЭДТА в качестве функционального теста. Дру~ой подход, применяемый лазя очистки мРНК, также основан на использовании ро!у(Л)-конца. Суть данно- 122 Часть 11. Синтез белков го метода состоит в отжиме ро1у(А)-участка с короткими олиго-(г1Т)-фрагментами, которые функционируют в качестве стартовой точки, или затравки, для обратной транскриптазы (ревертазы), фермента, который копирует мРНК, образуя при этом цепь комплементарной ДНК (обозначенную как кДНК).

Затем эту кДНК можно использовать в качестве матрицы для синтеза второй цепи ДНК, которая идентична первоначальной последовательности мРНК. Продуктом этих реакций является двухцепочечная ДНК, последовательность которой полностью соответствует последовательности мРНК. Такая ДНК может быть легко «клонирована» с помощью хорошо разработанной технологии (гл. 19). Любая клонированиая ДНК может быть получена в огромных количествах, что дает возможность выделить соответствующую мРНК, используя для этого метод гибридизации. С помощью такого методического приема можно выделить мРНК, представленные всего лишь несколькими копиями в клетке, тогда как непосредственно, без применения техники клонирования, могут быть подучены лишь те мРНК, которые присутствуют в относительно больших количествах.

Эукариотические МРНК имеют метилированный «кзп» на 5'-конце Как и в случае друпгх нуклеиновых кислот, при транскрипции в мРНК включаются только четыре обычных рнбоиуклеотида. Затем с помощью модифицирующих ферментов в специфические сайты молекулы вводятся дополнительные группы. 5зконец цитоплазматнческой мРНК эукариот (но не митохондриальной или хлоропластной) подвергается модификациям двух типов. Возможно, что эти реакции характерны для всех эукариотических клеток.

Транскрипция начинается с нуклеотидтрифосфата (обычно с пурииа, А или О). Первый нуклеотид сохраняет 5'-трифосфатную группу и образует обычную фосфодиэфирную связь между своим С-3' и С-5' следующего нуклеотнда. Таким образом, изначальная последовательность транскрипта может быть представлена в следующем виде: 5' ррр~рчририрйр Однако если зрелую мРНК обработать ш ч!гго ферментами, гидролизующими ее до отдельных нуклеотидов, то ее 5'-конец не образует предполагаемого иуклеозндтрифосфата. Вместо этого он образует два нуклеотида, содержащих метильные группы и связанных между собой трифосфатиой связью 5' — 5'.

Концевое основание всегда представлено гуанином, который добавляется к нативной молекуле РНК посттраискрипционно. Присоединение 5'-коицевого О катализнруется ядерным ферментом — гуанилилтрансферазой, Эта реакция происходит сразу же после того, как началась транскрипция, так что в ядерной РНК можно обнаружить только следовые количества первоначальных 5'-трифосфатных концов. Суммарная реакция может быть представлена как взаимодействие между ОТР и нативным 5' трифосфатным концом РНК: 5' 5' пррр ь рррдра1рир .

5' 5' арррдрнрир + рр + р Реакция может протекать в две стадии. На первой стадии фермент ковалентно связывается с донорным остатком ОМР (пнрофосфат при этом теряется). Затем ОМР присоединяется к РНК, которая при этом теряет 7- фосфатную группу. В результате оказывается, что добавляемый остаток О находится на конце РНК в обратной ориентации по отношению к остальным нуклеотидам. Эта структура в мРНК получила название «кэпи. Она служит субстратом для реакций метилнрования, происходящих в определенных положениях и в определенном порядке. Окончательная структура кэпа после всех возможных актов метилирования изображена на рис. 9.6. Первый этап метнлирования происходит у всех эукариот; он состоит в добавлении метильной группы в 7-е положение концевого гуанина.

Фермент, осуществляющий эту реакцию, гуанил-7-метил-трансфераза, находится в цитоплазме. Как н все остальные метилазы, он использует в качестве кофактора Я-аденозилметиоиин, который служит донором метильных групп. Кэп, имеющий только одну метильную группу, обозначается как кэп О. Такая структура кэпа встречается у одноклеточных эукариот. Затем происходит добавление еще одной метильной ~ руины к 2'-0-положению предпоследнего основания (т.е.

фактически к первому нуклеотиду первоначального, еще не модифицированного транскрипта. Эта реакция катализируется другим ферментом (2'-0-метил — трансферазой). Кэп, который имеет две метильные группы, называется иэном 1. Это основная форма кэпа у всех эукариот, кроме одноклеточных организмов. В редких случаях у высших эукариот ко второму основанию добавляется еще одна метильная группа.

Это происходит только тогда, когда во втором положении находится адении, и в результате реакции в )х('-положение добавляется вторая метильиая группа. Фермент, катализирующий эту реакцию, 2'-0-метиладснозин-)х(ь-метилтрансфераза, воздействует на аленозиновый субстрат только в том случае, если у него уже имеется метильная группа в положении 2'-О.

У некоторых видов метильная группа может добавляться к третьему основанию кэпированной мРНК. Субстратом для этой реакции служит мРНК с кэпом 1, которая уже имеет две метнльные группы. Модификация третье~о основания всегда заключается в метилироваини 2'-0-положения рибозы. В результате образуется структура, называемая иэном 2. Если это происходит, то кэпы такого типа обычно составляют 10 — 15". от суммарной кэпированиой популяции молекул.

В популяции эукариотических мРНК каждая молекула имеет кэп. Соотношение разных типов кэпов является характерной особенностью данно~ о организма, Остается ли структура молекулы мРНК неизменной, или же в процессе ее функционирования может происходить смена разных типов капов? На основе имеющихся в настоящее время данных нельзя еше дать ответа на этот вопрос. Кроме метилироваиия при формировании кэпов в мРНК юлько высших эукариот происходит, хотя и с низкой частотой, метилирование внутренних нуклеотидов. В результате это~о процесса образуется модифицированный остаток )х( -метиладенина, встречающийся примерно один раз иа тысячу оснований.

мРНК высших эукариот может содержать 1 — 2 метиладеииновых остатка, хотя существование этих иуклеотидов вовсе не обязательно, поскольку в некоторых мРНК (например, глобиновых) их нет совсем. 9. Информационная РНК как матрица для синтеза белка 123 Рвс. 9.6, рован в Возможности трансляцнонных систем (п Мго Опыты по транслированию мРНК (п чйго сыграли решающую роль в изучении процесса трансляции. Воцсрвых, можно получить определенные ланныс о кодирующих функциях любой конкретной мРНК, доказав, что образующийся продукт обладает теми же свойствами, что и белок.

синтезирующийся ш в(чо. (Обычно об этом судят по злектрофоретической подвижности.) (Часто это можно проанализировать более детально, установив нуклеотидную последовательность мРНК (как правило, используя для этого ДНК-копию) и обнаружив, что она содержит соответствующую кодирующую область. В ряде случаев, конечно, используя нуклеотидную последовательность мРНК, можно предсказать аминокислотную последовательность неизвестно~ о белка.) Системы (п чйго (как в случае транскрипции, так и в случае трансляпии) дают уникальную возможность исследовать мехааизм самого процесса. В обоих случаях определяющим этапом является инициация. С помощью трансляционной системы можно исследовать характерные особенности рибосом н мРНК, необходимые для нх взаимодействия.

Хотя в общих чертах трансляционная система ш в(тго во многом напоминает процесс, происходящий ш в(во. известно два случая, когда различия между продуктами трансляции 1п виго и (п вгхо дают нам интересную информацию для размышлений. Иногда бывает возможно выделить мРНК, которые транслируются 1п виго, хотя соответствукицие белки не синтезируются в тех клетках, из которых данные мРНК были получены. Способность мРНК транслироваться (п чйго доказывает, что в принципе эти молекулы могут функционировать в качестве матрицы.

Следовательно, неспособность таких РНК функционировать (п Ичо объясняется, очевидно, наличием контроля на уровне траисля- сях л~вв~~вв Е)й;!""М ц ч Ввсввипт ции. Должно быть, ш Иво функционирует некий механизм, препятствующий трансляции. «Законсервированные» РНК-частицы эмбрионов морских животных, о которых мы упоминали ранее,— наиболее хорошо изученный пример такого явления.

Характеристики

Список файлов книги