Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 57
Текст из файла (страница 57)
В последующих главах мы полробно разберем все факторы, участвующие в реакции транскрипции РНК с ДНК-матрицы, В данной главе мы рассмотрим механизм транскрипции и свойства препаратов РНК-полимеразы, очищенных обычным путем. В гл. 11 будет обсуждаться природа промоторов. Затем в гл. 12 и 13 мы подойдем к вопросу о контроле процесса транскрипции РНК-полимеразой бактерий. В клетках бактерии-хозяина и в клетках, инифицированных фагом, процессы инидиации и терминации регулируются путем использования дополнительных белковых факторов, которые модифицируют или коренным образом изменяют важнейшие свойства РНК-полимеразы. Суо ьеди11ичная структура бактериальной РНК-полимеразы У бактерий синтез мРНК, рРНК и тРНК осуществляется одной и той же РНК-полимеразой. Общее количество молекул РНК-полимераз, присутствующих в клетках Е.
сей, может составлять 7000. Значительная часть из ннх, по-видимому. участвует в транскрипции. В зависимости от условий роста в синтезе РНК может быть занято одновременно от 2000 до 5000 молекул фермента. Кроме основной РНК-полимеразы в клетке существует еще один белок (продукт гена ОпаС), осуществляющий синтез РНК- затравок, необходимых для репликации ДНК. Однако функции этого белка в синтезе РНК ограничиваются только этим продессом (гл. 33). Лучше всего охарактеризована РНК-полимераза из Е.
гоп! ее субъединичная структура аналогична структуре всех других изученных вилов бактерий. Полный фермент, или голофермент, имеет мол. массу около 480000 дальтон. Он состоит из следу!ощих субъединиц: 2 а по 40000 каждая 1 !) 155000 1 1!' 160 000 1 о 55000 п-. (3- и (3'-субъединицы разных видов бактерий имеют довольно близкую молекулярную массу: молекулярная масса о-субъелиницы варьирует в значительных пределах— от 44000 до 92000 дальтон.
Фермент имеет несколько вьпянутую форму, и его максимальные размеры составляют 15 нм. Голофермент (пар()Ъ) можно разделить биохимическими методами на два компонента: минимальный фермент (парр') и сигма-фактор (гг-полипептид). В названии компонентов отражен тот факт, что только голофермент может инициировать транскрипцию, а далее сигма-фактор освобождается из комплекса и собственно элонга|гия осуществляется минимальным ферментом. Таким образом, минимальный фермент способен синтезировать фосфодиэфирные связи на ДНК-матрице, но он не может инициировать транскрипцию в нужном участке.
Сигма-фактор контролирует связывание РНК-полимеразы с ДНК Основная функция сигма-фактора состоит в том, чтобы обеспечить стабильное связывание РНК-полимеразы с промоторами, а не с другимн участками ДНК. Минимальный фермент сам по себе имеет сродство к ДНК; в основе этого сродства лежит электростатическое взаимодействие между положительно заряженным белком и отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. Возможно, что способность к связыванию любой ДНК независимо от ее иуклеотидной последовательности характерная особенность всех белков, имеющих специфические участки узнавания на ДНК (гл.
14), Случайная последовательность ДНК, которая связывается РНК- полимеразой, называется слабым участком связывания, а комплекс ДНК фермент закрытым, поскольку ДНК в этом комплексе находится в двухцепочечной форме. Константа связывания при формировании закрытого комплекса в участке слабо1 о связывания составляет 2.10" М ', а полупериод диссоциацни комплекса на фермент и ДНК -около 60 мин, Сигма-фактор принципиально изменяет характер взаимодействия РНК-полнмеразы с ДНК. У голофермента сродство к слабым участкам связывания, т.е. любым последовательностям ДНК, резко снижено.
Константа связывания для этой реакции составляет 10' М ', а ее период полужизни менее 1 с. Таким образом, сигма-фактор нарушает способность фермента связываться со случайным участком ДНК примерно в 10000 раз, и образующиеся комплексы ДНК фермент становятся очень коронькоживуи!ими. Но сигма-фактор сообщает ферменту способность узнавать снвиифическив участки связывания. Голофермент может очень прочно связываться с промоторами; константа связывания при этом составляет 10'4 М ', а полупериод жизни образующегося комплекса длится несколько часов. Эта констан га ассоциации является Часть П1.
Синтез РНК 134 Гояафермеиг Связывание а дык Заирьпмй ' .=-'-., 'у комппена Покорное ппавпение дик Открьпмй двойной комплекс Образование Фаафодизфирной связ тройной ;ЬЯ ьесмьсхзЯгг, и ьг 'ьдьсх Ьк комплекс Паапе образов ванна первой аабхЗЯЯ свав с гмв.фз тар освобмкавепм + из комплексе (Р) н минимвиьнмй фермент прадопмаег синтезировам рык Рнс !О.! Инициирование транскрипции происходит в несколько последовательных этапов, в процессе которых закрытый дкойной комплекс пеРеходит в откры.сыйз б затем в тРойной комплекс.
усредненной величиной. На самом деле существуют примерно стократные вариации в скорости связывания фермента с различными промоторами (в зависимости от конкретной нуклеотндной последовательности ДНК), что имеет принципиальное значение для частоты инициации с соответствующего промотора. Как показано на рис. 10.1, распознавание промоторов голоферментом существенным образом отличается от реакции минимального фермента со слабыми участками связывания.
Взаимодействие голофермента с промотором начинаемся с формирования аналогичного закрытого (бинарного) комплекса. Но затем он переходит в открытый комплекс. При этом происходит плавление небольшого участка ДНК в пределах той последовательности, которая связана с ферментом. Обычно фермент экранирует примерно 60 нуклеотидных пар молекулы ДНК, внутри которых 12 — 17 пар нуклеотидов (согласно разным определениям, см, далее)находятся в неспарениом состоянии и образуют участок с одиоцепочечиой структурой.
В результате ряда последовательных событий, приводящих к формированию открытого комплекса, происходит прочное связывание. Поскольку РНК-полимеразе необходимо нарушить структуру ДНК, образование открытых комплексов и транскрипция быстрее протекают на отрицательно суперспирализованной кольцевой ДНК, чем на линейной.
То напряжение, которое возникает в двойной спирали в результате суперспирализации, облегчает расплетание двух цепей. Это может иметь важное значение для инициирования !ранскрипции по крайней мере на некоторых промоторах (гл. 11). Поскольку образование промоторов предполагает разделение цепей ДНК, то открытый комплекс между голоферментом и ДНК менее стабилен в условиях низкой температуры и высокой ионной силы, тог- да как для закрытого комплекса между минимальным ферментом и ДНК характерна противоположная зависимость от этих параметров.
Особенности этих типов связывания указывают на то, что РНК-полимераза может находить промоторы методом проб и ошибок, как это показано на рис. 10.2. Любой не работающий в данный момент в клетке минимальный фермент скорее всего существует в форме закрытых слабых комплексов, поскольку образование таких комплексов происходит быстро, а распад — медленно, (К сожалению, точно не известно, какая часть молекул свободных РНК-полимераз клетки существует в форме минимального фермента и какая представлена голоферментом.) Голофермент очень быстро ассоциирует со слабыми участками связывания и также быстро отделяется от них. Таким образом, продвигаясь вдодь молекулы ДНК, голофермент образует и разрушает ряд закрытых комплексов до тех пор, пока в процессе поиска (случайио) не натолкнется на промотор.
Тогда в результате узнавания специфической последовательности ои может прочно связаться с ДНК в нужном участке и образовать открытый комплекс. Константа скорости связывания с промоторами очень близка к тому пределу, который определяется скоростью диффузии. Поскольку связывание происходит очень быстро, то скорость данного процесса ограничивается в основном скоростью диссоциации голофермента от слабых Медленно ф — " Ф вЂ” -~ Бьмграг б" "э Б' роф ) ьъ„ сярмчрьрмьяйьсья,ьрыьяябья быс ра ЬРКХККЗРЬбтбХЗРЗОЗЖбЬЖЯРхЗДЬЯРЬЯЗ 'зг,'л Ь.з~ О,знь быатро Я + Быстро с 'Ф 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1 Рнс. 102. Цикл сигма-фактора и минимального фермента прп травскрипдии. Освобождение минимального фермента проксхолнт пря тсрыннаднн, после чего он лкбо связывается со свобопнымн участками ДНК, либо с сигма-фактором.
образуя голофсрмент, который стабильно взаимодействует только с промоторамн Сигма-фактор отпслясзся сразу жс. «ак только образуется тройной «омплскс. 10. РНК-полимеразы — транскрипционный аппарат участков связывания. Однако это происходит слишком медленно, примерно 1 диссоциация в секунду.
Следовательно, РНК-полнмераза может использовать другое средство для поиска участков связывания, возможно путем прямой замены одной связывающей последовательности на другую. Эта реакция может происходить со скоростью около 1 замены в миллисекунду. Иными словами, вместо того чтобы двигаться вдоль цепи ДНК, оставляя один участок связывания и диффундируя к другому, фермент, вероятно, хватается за одну последовательность ДНК, меняет ее быстро на другую и продолжает в той же беспорядочной манере обменивать последовательности, пока не доберется до промотора. После этого фермент образует стабильный открытый комплекс, и начинается инициация. Каким образом сигма-фактор влияет на способность минимального фермента ассоциировать с ДНК? Проведенные ранее эксперименты указывали на то, что сигмасубъединица непосредственно не связывается с дуплексом ДНК. Однако возможно, что она способна взаимолействовать с ДНК, находящейся в суперспиралнзованном состоянии, хотя мы не имеем данных о том, может ли она сама узнавать специфические нуклеотидиые последовательности.
В то же время известно, что когда голофермент образует прочно связанный комплекс с промотором, сигма-фактор контактирует с ДНК в области начального плавления, в точке, расположенной непосредственно перед стартовой точкой транскрипции. Добавление сигма-фактора может изменить коиформацию минимального фермента таким образом, что он менее эффективно распознает слабый участок связывания и уже в форме голофсрмепта может специфически контактировать с участками прочного связывания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
