Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 61
Текст из файла (страница 61)
По ходу транскрипции происходит нарастание порядковых номеров оснований. Позиции оснований, расположенных против хода транскрипции, обозначаются со знаком минус, и значения номеров возрастают по мере удаления от стартовой точки. Ис'пользуя эти обозначения, можно написать, что экраниРуемый РНК-полимеразой фрагмент расположен в пределах от — 20 до +20. Участки связывания обладают той характерной особенностью, что, будучи выделенными в чистом виде, они не могу~ повторно связываться с РНК-полимеразой. Это означает, что хотя данный фрагмент и является последовательностью, прочно связывающей РНК-подимеразу и, кроме того, способной инипиировать транскрипцию, его одного недостаточно для изначального связывания фермента.
Для осуществления процесса узнавания необходимы другие последовательности, расположенные вне этого фрагмента. Следовательно, в состав промотора входят как прочный участок связывания, так и зти добавочные последовательности. Исходя из приведенных данных, можно предположить существование двух возможных типов структур промоторов, Возможно, весь промотор является участком связывания фермента, но дополнительные последовательности в меньшей степени ассоциированы с фермент.ом или менее защищены и, следовательно, чувствительны к нуклеазе, хотя прочно связанные последовательности экранируются ферментом.
В этом случае разногласия между строением экранируемого фрагмента и его неспособностью к повторному связыванию фермента отражают геометрию взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК. Можно допустить также, что промотор состоит из двух видов последовательностей. Взаимодействие фермента с первой последовательностью, возможно, является необходимым условием для связывания со второй. При переходе от узнавания к прочному связыванию могут происходить конформационные изменения — например, укорачивание ДНК, в результате которого фермент закрывает только экранируемую область.
С другой стороны, эти изменения могут быть связаны с перемещением фермента от места первичного узнавания к прочному участку связывания. Способность РНК-полимеразы взаимодействовать с определенными участками ДНК можно исследовать с помощью метода отпечатков. Для этого РНК-полиме- | Про ос сена панне Рннмопимераам с опредепемнай облает о днк Обработка уклеааой то Рб",гем.„.,пк а ~~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~ ~ ! У ~ ~ ~ ~ ~ ~ с ~ ~~ Р Оплетка днк дбъъьл роегто Определение последоеателанослт акранироеанного Ерагммоа Рнс. !!.3.
Фрагменты ДНК„связывающие РНК-поднмерйзу, могут быть получены благодаря тому, что онн зйщнтнсны ферментом от деградации нуклбазой. разе или другому белку дают возможность связаться с ДНК, которую затем частично гидролизуют эндонуклеазой. В результате независимо гидролизуются различные фосфодиэфириые связи нуклеиновой кислоты.
При определенных условиях каждая фосфодизфирная связь подвергается действию нуклеазы, но при этом гидролиз данной связи происходит только в ограниченном числе молекул ДНК, Если РНК-полимераза блокирует доступ нуклеазы к ДНК, то определенные связи вообще не будут разорваны. Местоположение подвергшихся гидролизу связей определяют, вводя метку в одну из цепей ДНК, причем только в один ее конец.
Как показано на рис. ! 1.4, фрагменты ДНК, полученные после нуклеазной обработки, разделяют по размеру при помощи электрофореза в геле. )Принципа лежащий в основе частичного расщепления каждого гидролизуемого участка с последующим выделением меченных по концу фрагментов, тот же самый, который был использован при определении последовательности ДНК; см. рис.
3.4.) Каждой гидролизоваиной связи на геле соответствует полоса, подвижность которой определяется расстоянием от меченого конца до места разрыва. В участке, защищенном от гидролиза РНК-полимеразой, разрывов не происходит и соответствующие полосы на геле отсутствуют. Каждая из двух цепей ДНК, меченных радиоактивным изотопом, может быть проанализирована по отдельности. Сравнивая полученные отпечатки с результатами определения последовательности ДНК, устанавливают нуклеотидиую последовательность участка связывания и его местоположение. В результате такого анализа одного из промоторов !для 1ас-генов) было показано, что участок связывания РНК-полимеразы более обширный, чем тот, который обнаруживается при непосредственном выделении экрани- 142 Часть Ш.
Синтез РНК ЯЯб~.'Ю~|МЯ6~~ЯЖ Частичный гцжюлце ДН Кахой ! омвлексе РНК цолцыереха ° лроыагор Радиоактивной меткой памече» один це ЫЪ|ЮЫ. МбЮ~ЯбЮМчМЪЯ7 ФАУММЫБЪ~ъ~Ф7 Я~бЮ~Ю~Яб~ЪЯЯ~Ю ~9бЪЯбб~МЮЖЮ~ъ' 31 эе 29 3!в 30 26 28 27 26 25 7~МйЮМЪ|ЛббУЫЮ~ОУ Нацбовьшее уаавенцеог ые вюго «овце 28 27 26 25 24 — 23 22 21 24 23 22— 21 20 18 18 17 1б 15 По слу О СУ7СГЕУЮ ццх мной олре цел юг цл у учес к селэ евошего белан 14 !3 !2 и оцнецево ш7иыыц Реерывамц Ачцагурцруюг ц Раеяеляют ма!оном мек7рофорееа 1О в 8 7 е 7 блцхийшее лево!ценив к ечпюму «овцу б 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 П геле, на который былацаиеее аол иная ДНК, цыеегс» облжть, це солержашцч полос.
Оке соответствует ыестопола- ХЮВЦЧ! ЭЦРЕВЦРОеен . ного волцмереаой участка П ГЕЛЕ С КОЦГРО76. ной дНК полосы обцюужцваютсл во всех воложевцях, СООГВЕГСПГуЮшвк каждой разорванной свяец Рнс. 11.4. Исследование участков ДИК, связывающих белки, с помощью метода «Отпечатков». Принпип метода состоит в том, что в условиях частичнОго гидролиэа каждая фосфодиэфнрная связь в свободной Днк разрушается в какойдибо иэ молекул.
Участок ДНК, экранированный связавшимся белком, эащипшн ат нуклеаэы во шжх молекулах. Параллельно проводятся две реакпии с контрольной, очищенной ДНК и с опытной, провэаимодействовавшей с белком. Затем, если цепи ДНК раэдслить и подвергнуть электрофоретическому анализу, то образуются радиоактивные полосы, соответствующие фрагментам ДНК О мечеными копнами Местоаоложение фрагмента соответствует числу содержащихся в нем оснований. Более короткие фрагменты Обладают болыней подвижностью, поэтому последовательность читается в направлении от основания геля вверх гсм. рис.
3.4) В контроле нее 4 5 $ х связи гидролиэуются, образую серию полос, соответствующих каждому основанию. На рисунке можно насчитать 31 полосу. В экрани1юванноы фрагменте связи нс могут быть гидролиэованы, поэтоьгу пагюоы определенного раэыера, соответствующие фрагменту, свяэаиному с белком, не обраэуются. На рисунке полосы от 1О до 20 отсутствуют. Следовательно, сайт, свяэывающий блок, располагается от 1О-!а до 20-го основания, считая от меченого канна ДНК. Можно изменить условия опыта и разделять фрагменты ДНК не то7!ько по длине, но н одновременно определять их иуклсотидную последовательность.
Для этого контрольную и опытную ДНК можно обработать, «ак покаэаво на рис. 3.5, и далее приготовить па четыре геля для определения нуклеатидной последовательности ДНК. Сравнение двух наборов гелей позволяет прочитать последовательность ДНК иеносрелствснио в том участке, который связывает белок. Коричневыми стрелкамн покаэано действие ДНКаэы. Стрелками показан гидролиэ ДНК-аэой. 11.
Промоторы: сайты инициации транскрипции руемых фрагментов. Размеры этого участка составили около 50 п.н., если считать от стартовой точки против хода транскрипции, и около 20 п.н.-по холу транскрипции. Обе цепи ДНК не одинаково хорошо защищены — в особенности на концах связывающего участка. Из этого следует, что РНК-полимераза, связываясь с ДНК, находится в асимметричной конформации. Приведенные факты согласуются с данными о том, что при транскрипции считывается только одна цепь ДНК. Похожие результаты мокнут быть получены в экспериментах с использованием энзонунлеазы. Этот фермент действует на концевой участок ДНК н последовательно его деградирует.
Если с ДНК связан белок, то при столкновении с ним действие нуклеазы прекращается. В данном случае также можно определить границы промотора, т.е. точки, расположенные по обе стороны от него, далее которых экзонуклеаза не может продвинуться, Таким образом, еще раз подтвердилось, что последовательность, связывающаяся с РНК-полимеразой, расположена примерно на 44 п.н.левее стартовой точки транскрипции. В совокупности эти результаты показывают, что РНК-полимераза связывается, причем асимметрично, с участком ДНК размером около 44 — 50 п.н., если считать от стартовой точки против хода транскрипции, и около 20 п.н. — по ходу транскрипции.
Последние 25 — 30 п.н. в связывающем участке, расположенные против хода транскрипции, менее прочно взаимодействуют с ферментом. Эта область связывается с ферментом достаточно хорошо, чтобы быть экранированной при мягкой обработке энда- илн зкзонуклеаэами, но не может выдерживать более жесткие условия обработки, используемые для получения целых фрагментов связанного ферментом участка. Приведенные данные хорошо согласуются с моделью, согласно которой существует единый связывающий сайт для РНК-полимеразы, в котором (как мы увидим) некоторые точки контакта имеют более важное значение, чем другие.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
