Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Последовательность, расположенная слева от этой зоны, не нужна для связывания. По всей видимости, этот участок связывает только один БАК-димер, и он, вероятно, непосредственно контактирует с РНК-полимеразой, так как БАК-связывающий сайт перекрывается с участком, экранируемым РНК-полимеразой. В ага-опероне БАК-связывающая зона для единственного БАК-димера находится еще дальше от стар~оной точки и распола1ается между положениями — 107 и — 78. В данном случае БАК не может контактировать с РНК- полнмеразой потому, что другой регуляторный белок связывается с областью, расположенной межлу сайтами связывания БАК и РНК-полимеразы, Одна из моделей, описывающая действие БАК, утверждает, что оно состоит в белок-белковом взаимодействии, опосредованном связыванием с ДНК.
Незначительного взаимодействия между двумя белками буде~ достаточно для достижения существенно~о увеличения сродства РНК-полимеразы к лромотору. Геометрия взаимодействия БАК и РНК-полимеразы в случае 1ас- и яа1- оперонов, по-видимому. должна быть различной, а в случае ага-оперона необходимо постулировать участие трех белков. Другая возможность состоит в следующем: эффект, оказываемый БАК, полностью проявляется в результате его связывания с ДНК. Возможно, что в БАК-эависимых промоторах РНК-полимераза не может осуществлять первоначальное плавление ДНК. Это мог бы сделать БАК таким образом, чтобы расхождение цепей началось от места его связывания и продолжилось бы на соседние участки. С этой моделью согласуются данные о том, что мутации в топоизомеразе1.
описанные в последнем разделе, устраняют зависимость этих оперонов от БАК, позволяя им функционировать без его помощи. Возможно, что увеличение суперспирализации (и связанное с этим расхождение цепей) представляет собой альтернативу действию БАК. С помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов БАК удалось обнаружить, что он состоит из двух доменов. Возможно, что малый С-концевой домен ( - 65 аминокислот) связывается с ДНК, поскольку известно, что большой 1э'-концевой домен [ 135 аминокислот) связывает сАМР.
В одной из моделей строения С-концевого домена постулируется, что он способен образовывать надлежащие контакты только с ДНК, находящейся в левозакрученной В-конформации. Если в результате связывания БАК с ДНК возникает левозакрученный участок рядом с промотором, это вызывает образонание расплетенной области, внутри которой происхолит переход в обычную правозакрученную форму. Этому (предполагаемому) эффекту содействует сулерспирализация. Различные опероны, контролируемые БАК, различаются по степени зависимости от этого белка. Как это связано со структурой конкретного промотора, не ясно. но одно из предположений состоит в том, что эта зависимость коррелирует с наличием среднестатистической последовательности — 35.
В ее отсутствие степень зависн- !1. Промоторы: сайты инициации транскрипции 149 мости от БАК возрастает. Возможно, взаимодействие РНК-полимеразы с положением — 35 и БАК с ДНК выполняют родственные функции при инициировании транскрипции. Возможные консервативные последовательности для РНК-полимеразы 11 Первые попытки обнаружить сходство в эукариотических промоторах были предприняты при сравнении нуклеотидных последовательностей, расположенных против хода транскрипции от стартовых точек у различных генов.
Поскольку РНК-полимераза1 транскрибирует только гены, кодирующие идентичные рРНК, то в данном случае нет возможности вычленить последовательность промотора. В случае РНК-полимеразы 1и число изученных генов, выделенных из одного источника, было недостаточным !правда, все равно оказалось, как мы увидим далее, что промотору не обязательно располагаться непосредственно слева от кодирующей области).
В случае РНК-полимеразы и была определена последовательность множества генов !нескольких сотен) из разных источников и охарактеризованы их стартовые точки. Исходили из предположения, что первое основание мРНК соответствует сайту инициации, а не образуется в результате процессинга большего предшественника. В нескольких случаях правильность этого предположения была строго доказана по совпадению сайтов инициации )п чпго со стартовой точкой для мРНК Так же как и в случае бактериальных праматоров, гомология вблизи стартовой точки неполная.
Существуюз три участка, в которых была обнаружена значимая гомология; стартовая точка, участок, расположенный в районе положения — 25, и участок в районе положения — 75. У стартовых точек не наблюдается значительной степени гомологии, но обнаруживается тенденция, что первым основанием в мРНК является А, граничащий с обеих сторон с пиримидинами. Почти повсеместно встречается определенная последовательность из 7 п.н., отделенная от стартовой точки расстоянием от 19 до 27 п.н.
Эта семичленная последовательность была обнаружена у млекопитающих, птиц, амфибий и насекомых. Во всех изученных случаях !независимо от источника) среднестатистическая последовательность имеет следующий вид: Тег Аы Тэз Аеэ Т Авзт Абз Аю Тз7 Тэз Часто эту последовазельность называют ТАТА или блоком Хогиесса. Эта каноническая последовательность всецело состоит из А — Т-пар 1в двух положениях ориентация этих пар может изменяться). Только в незначительном числе описанных случаев присутствует пара Π— С. Блок, как правило, окружен последовательностями, богатыми Π— С, которые, возможно, принимают участие в его функционировании.
Он почти идентичен с блоком Прибнова, обнаруженным в бактериальных промоторах. Действительно, единственное существенное отличие состоит в локализации этих участков. Блок Хогнесса располагаезся предпочтительно в положении -25, тогда как блок Прибнова — в положении — !О.
Видимо, эта структура ие абсолютно необходима для транскрипции, так как извест- на пара случаев, когда данная последовательность вообще отсутствует. Далее против хода транскрипции имеется другая последовательность, которая у некоторых промоторов консервативна, хотя в ряде других случаев она отсутствует. Эта последовательность располагается между положениями — 70 и — 80, и ее канонический состав имеет вид аоссддтст Т Иногда она обозначается как СААТ-блок. Мы еще не знаем, является ли она характерным свойством всех промоторов или же присуща только определенному классу.
Системы транскрипции )п У!!го И 1П У1ЧО При попытках выявить промоторы для эукариотических РНК-полимераз были использованы те же подходы, с помощью которых ранее исследовали бактериальные РНК-полимеразы. Эукариотическим системам свойственны два ограничения. Первое: )п чгко фактически не было получено мутаций, затрагивающих промотор. Поэтому мы не располагаем какой-либо предварительной информацией о локализации эукариотических промоторов. Второе: пока не было возможности непосредственно охарактеризовать участки, связывающиеся с какой-либо из РНК-полимераз. Это объясняется сложностью выделения ферментного препарата и отсутствием информации о том, чтб именно образует активную структуру фермента, хотя, конечно, создание удобной системы, с помощью которой можно будет извлекать ДНК-связывающий сайт из состава инициирующегося комплекса,- дело времени.
Менее прямой, но в некоторых случаях более информативный подход состоит в определении промотора как структуры, способной инициировать транскрипцию в подходящей тест-системе. Для этого используются три типа систем. В системе )п чйго используется классический полход: проводят очистку всех компонентов и подбирают условия, при которых наблюдается правильная инициация. «Правильнаяв инициация определяется как процесс образования РНК, начинающийся в сайте, соответствующем 5'-концу мРНК. В последнее время появилась возможность осуществить это в отношении каждой из трех эукариотических РНК-полимераз. Имеющиеся системы характеризуются различной степенью очистки. В состав некоторых систем входят неочищенные клеточные экстракты, содержащие РНК-полимеразу, в других — фермент добавляют к клеточному экстракту.
В дальнейшем эти системы должны быть заменены препаратами, содержащими все охарактеризованные компоненты, и тогда ш чйго можно будет сравниваз'ь активности РНК-полимераз из различных тканей и объектов. Система, с помощью которой исследуют транскрипцию в ооцитах, в принципе напоминает систему, использованную для исследования трансляции.
В ее основе лежит введение подходящей ДНК-матрицы в ядра ооцитов Х. !аеиж Синтезирующуюся РНК можно выделить и проанализировать. Основное ограничение этой системы состоит в том, что она полностью лимитирована условиямн, существующими в ооците. В случае сне~ем )п ч!чо не обязательно (как можно было бы предположить из их названия) исследовать способность используемых клеток транскрибировать свои ! 50 Часть 111. Синтез РНК обычные гены. В данном случае исследуется только способность клеточной культуры транскрибировать матрицу, которая вводится в систему посредством трансфекции (механизм, с помощью которого экзогенная ДНК может проникнуть в клетку и существовать в ней, более детально описывается в гл. 38).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
