Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Промоторы; сайты инициации транскрипции 145 Комллемвплрнм пель Матричная цель цремоюрнме мутацн» Комллнлштарн*л х цель Матрлчла» цель Рис. (( 5 Точки контакта для РНК-цолимеразы находятся на одной поверхности ДНК, образующей цромотор. Последовательность ДНК представляет типичный промотор с консерватнвнымн последовательностями в положениях — 35 и — (О. Область первоначального разделения цепей начинается от блока Прибнова и закаачнваетс» сразу за стартовой точкой.
В верхней части рисунка стрелками, направленными к двойной спирали, указаны святы, модификация которых нарушает связывание РНК-полнмераэы с ДНК. Сайты, экранируемые ферментом от модификаций, обозначаются стрелками, направленными от двойной спирали Стрелки, направленные на основание, указывают само модифипированное основание.
Стрелки между основаниями обозначают модифнкапию фосфодизфирной связи. ризовать взаимодействие между РНК-полимеразой и мутантным промотором тп у((го. Прн этом можно показать, на какое свойство промотора влияет мутация. Может ли они изменять сродство промотора к РНК-полнмерйзе? Может ли онн, не нарушив способности фермента, связываться с ДНК, помешать инициации? Изменяется ли под влиянием мутаций действие регуляторных факторов? На рис.
11.5 обобщены данные по локадизации точковых мутаций, влияющих на функцию промоторй. Почти все они попадают в две области, соответствующие положениям — 35 и — 10. Основания, расположенные в других положениях, очевидно, имеют менее важное значение или даже безразличны в случае подавляющего большинства (но не всех) промоторов. Распределение мутаций внутри блока Прибновя с центром в положении — 1О подтверждает важную роль трех консервативных оснований. Большинство (18 из 20) мутаций, ослабляющих транскрипцию, возникает в каком-либо нз этих положений.
Любая замена в димере ТА, расположенном в начйле блока Прибнова или в последнем Т, приводит к возникновению таких мутаций. Почти все эти мутации представляют собой замены пар А -Т на пары Π— С. Это служит еще одним доводом в пользу вывода о важном значении высокой концентрации пар А- Т. Однако незначительное число мутаций, возникших в результате трннсверсий от А — Т к Т вЂ” А или наоборот, показывает, что отсутствие пар О "С не единственное условие, определяющее функцию промотора.
Например, один Н средней части рисунка маленькими стрелками показаны сайты, нгняющие на функционирование промотора Стрелки, направленнью вниз, обозначают ослабляющие мутадии, а стрелки, направленныс вверх,-мутадии, усиэнваюшие инициирование транскрипции Показано суммарное число мутапий, обнаруженных длякаждого положения в случае всех изученных промоторов.
В нижней части рисунка представлена диаграмма, изображающая двойную спираль ДНК, спроектированную на пзоскость. Как видно из рисунка, все точки контакта расположены на одной поверхности. Большинство находится на комплементарной цепи (той, которая не является матричной). промотор в начале блока Прибнова вместо обычного ТА содержит АА, но в другом промоторе, имеющем ТА, мутационная замена, приводящая к появлению АА, проявляется в виде мутации, ослабляющей транскрипцию. Таким образом, основания должны действовать совместно; окружающие последовательности также играют важную роль в определении значения каждой позиции. Мутация, локалнзующаяся в области блока Прибнова и усиливающая транскрипцию, обнаружена в 1ас-промоторе, Промотор дикого типа имеет структуру ТАТОТТ.
Мутация, усиливающая транскрипцию, приводит к возникновению последовательности ТАТАТТ. Таким образом, ее эффект состоит в увеличении степени гомологни со среднестатистической последовательностью. Должна существовать кякая-то причина, в силу которой это увеличение эффективности не произошло спонтанно и не было закреплено отбором у бактерий. (Очень небольшое число других мутаций, усиливающих транскрипцию, было обнаружено в участке — 1О. Все они возникают в промоторах, у которых гомология с блоком Прибнова слишком незначительна, чтобы можно было понять механизм действия этих мутаций.
Однако вполне возможно, что они повышают степень гомологии со среднестатистической последовательностью.) Непосредственно слева от блока Прибнова (но еще в частично консервативной области — 10) возникают другие мутации, способные как усиливать, так и ослаблять экспрессию гена. Место возникновения таких мутаций свиде- 146 Часть 1П. Синтез РНК тельствует о том, что рассматриваемая часть промотора взаимодействует с РНК-полимеразой таким образом, что индивидуальное основание играет важную роль в данном промоторе, хотя они могут отличаться в других промоторах. Большинство мутаций в положении — 35 представляет собой замены, в результате которых в промотор вводится основание, неприемлемое в данном промоторе, хотя и вполне обычное для других промоторов.
Это еще раз подчеркивает важную роль эффекта, создаваемого окружающими последовательностями; РНК-полимеразе требуется не присутствие конкретного основания в каждом положении, а наличие определенно~ о сочетания оснований, локализованного в определенных участках. Некоторые основания никогда не обнаруживаются в определенных положениях, и возможно, что их отсутствие имеет более важное значение для процесса узнавания, чем наличие любых других оснований. Влияние мутаций в положении — 35 трудно интерпретировать, поскольку большинство из них возникает в промоторах, для связывания с которыми необходим дополнительный регуляторный фактор.
Поэтому вполне возможно, что данная мутация влияет на взаимодействие этого фактора с ДНК, а не на саму РНК-полимеразу (см. далее). Более равномерное распределение мутаций в этой области говорит о том, что существует меньшая концентрация определенных позиций внутри положения — 35 нли в ближайшем его окружении, любая из которых более или менее одинаково встречается в других промоторах. При анализе всех этих вопросов необходимо помнить, что усиливающие и ослабляющие мутации определяются относительно обычной эффективности, с которой работает промотор.
Эффективность различных промоторов варьирует в широких пределах. Поэтому изменения, выявляемые как ослабляющие транскрипцию в одном промоторе, в другом могут быть не обнаружены, причем такой промотор даже в отсутствие мутаций может быть менее эффективен, чем мутантная форма промотора первого типа. Поэтому для определения истинного эффекта этих мутаций необходимо проводить исследования ш чйго, что дает возможность изучать сродство РНК-полимеразы к различным промоторам ликого и мутантного типов в одинаковых условиях. 1п тйго наблюдаются приблизительно стократные различия в степени сродства РНК-полимеразы к различным промоторам. Этот разброс коррелирует с частотой транскрипции многочисленных генов |п ч(го.
ОСНОВНЫЕ ТОЧКИ КОНтаКта в промоторе Точки, с которыми РНК-полнмераза контактирует, находясь на промоторе, можно определять, обработав комплекс фермент промотор реагентами, модифицирующими определенные основания. Присутствие фермента может увеличивать илн уменыпать доступность определенного основания по сравнению с его доступностью в составе ДНК, не контактирующей с РНК-полимеразой. Изменение чувствительности оснований отражает геометрию комплекса и может быть использовано для описания его формы. Реагент диметилсульфат (ДМС) специфически взаимодействует с пуринами, метилируя остатки О в большой бороздке и остатки А в малой бороздке ДНК.
В результате метилирования пурины становятся чувствительными к нагреванию. Поэтому после прогрева ДНК лишается основания, на месте которого остается брешь; в этом положении фосфодиэфирная цепь может быть разорвана в присутствии щелочи. (Данная реакция используется при определении последовательности ДНК, как это было описано в 1л. 3.) Если тимин в ДНК заменяется на бромурацил (ВТ)с(К), то в результате ультрафиолетового облучения высвобождается бром. Это приводит к появлению свободного радикала, разрывающего цепь ДНК.
Этнлнитрозомочевина непосредственно атакует каркас ДНК. В результате фосфодиэфирная связь, соединяющая два нуклеотида, превращается в фосфотриэфирную (в результате алкилирования). Эта связь чувствительна к щелочи, и поэтому в данном месте ДНК может быть разорвана. Общее свойство всех этих модификаций состоит в том, что они лают возможность разорвать соответствующую связь в полинуклеотидной цепи.
Такой сайт можно идентифицировать с помощью тех же подходов, которые использовались в экспериментах по определению участков связывания РНК-полимеразы (рис. 11.4). Одну из цепей ДНК метят по концу; тогда в результате каждого разрыва образуется фрагмент, который обнаруживается при электрофоретнческом анализе как полоса в геле, соответствующая определенному размеру. Используя такой подход, сравнивают чувствительность комплекса РНК-полимераза лромотор с чувствительностью свободной ДНК.
В результате оказывается, что ряд полос пропадает. Таким путем выявляются участки промотора, экранированные ферментом от модификаций. Интенсивность ряда других полос может усиливаться, выявляя тем самым участки, в которых ДНК должна находиться в более доступной конформации. Эксперимент с использованием метилируюшего агента ДМС может быть проведен в обратном порядке. Сначала можно прометилировать ДНК, а затем воздействовать на нее РНК-полимеразой. При этом образуется набор молекул ДНК, метилированных в некоторых, но не во всех возможных положениях. Те молекулы ДНК, которые не смогли провзаимодействовать с РНК-полимеразой, подвергаются обычной обработке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
