Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Нн один из этих ферментов до сих пор не очищен в количествах, достаточных для тестирования в системе (п ч(гго. Рекомендуемая литература В качестве источника при написании многих обзоров и оригинальных исследовательских статей широко используется книга йг(А ро1утегазе, Со(д Брг(пя Ьабогагогу, Хеж Уог(с, 1976, вышедшая под редакцией Лозика и Чамберлина (Т.ох1сй, Слаебегйл). Две главы, освещаюгцие основные моменты излагаемого здесь материала, написаны Чамберлииом (СлаглЬегйн).
В них дается вначале общее представление о проблеме (стр. 17-68), а затем подробно рассматриваются вопросы взаимодействий бактериального фермента с матрицей (стр. 1 59 — 1 92). !!. Промоторы: сайты инициации транскрипции Глава 11 ПРОМОТОРЫ: САЙТЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ тертовев точке Основной вопрос, возникающий при исследовании взаимодействия между РНК-полимеразой и ее промотором, состоит в следующем: каким образом белок узнает специфические последовательности в ДНК? Имеешься ли в молекуле фермента активный центр, способный различать химическую структуру, образованную определеннымн основаниями в двуспиральной молекуле ДНК? Насколько фермент специфичен? Промоторы различаются своим сродством к РНК-полимеразе, что, возможно, имеет болыпое значение для контроля частоты инициации, а следовательно, и уровня генной экспрессии.
Каким образом изменения в последовательности ДНК сказываются на способности взаимодействовать с ферментом? Инициирование транскрипции — важнейший этап в осуществлении контроля генной экспрессии. При решении вопроса о необходимости экспрессии определенного гена часто этот этап является первым, а иногда единственным. Как контролируется способность РНК-полимеразы инициировать транскрипцию ва конкретном промоторе? На некоторых промоторах РНК-полимераза в принципе способна эффективно инициировать транскрипцию, хотя регуляторные белковые факторы могут препящствовать этому процессу. В других случаях одной полимеразы для инициации недостаточно и необходимо присутствие дополнительных белков.
Эти белковые факторы узнают последовательности ДНК, расположенные рядом с промотором или перекрывающиеся с ним. Таким образом, несмотря на то что промотор определяется как последовательностгь с которой взаимодействует РНК-полимераза, прилегающие области также могут оказывать влияние на способность фермента инициировать транскрипцию.
Промотор и прилегающие к нему участки контроля являются последовательностями ДНК, чьи функции — уэнаващьсл белками, и этим они принципиально отличаются от последовательностей, предназначенных для транскрибирования и последующего транслирования. Информация, необходимая для функционирования промотора, заложена в самой последовательности ДНК, т.е, сама структура ДНК служит сигналом. Экспрессируемые же области приобретают смысл только после того, как закодированная в ннх ннформапия преобразуется в форму другой нуклеиновой кислоты нли белка.
Промотор необходим для транскрипции определенной области ДНК. непосредственно к нему прилежащей. Согласно принятой в генетихе терминологии, последовагельности ДНК, не экспрессируюшиеся в виде диффузионных молекул РНК или белка, а выполняющие какие- либо другие функции, называются цис-доминантными или цис-активными участками. Это означает, что данные участки оказывают влияние только на последоватещности, расположенные в той же молекуле ДНК, в которой находятся онн сами. Они не могут влиять на гомологичные последовательности, расположенные в других молекулах ДНК (гл.
14). После того как на стартовой точке началась транскрипция, РНК-полимераза продолжает продвигаться вдоль матриды до тех пор, пока не достигнет терминатора, Последовательность, которая находится между промотором и терминатором, называется единицей транскрипции, Как это видно на рис.
11.1, транскрипционная единица является участком ДНК, кодирующим образование одной молекулы РНК, В зависимости от конкретной системы в состав транскрипцнонной единицы могут вхолить один нли несколько генов. Иногда область, находящаяся ближе к промотору, обозначается как прокснмальиая в отличие от листальиой, расположенной вдали от него. Определение стартовой точки 1п угуо и (п ц1(го Стартовой точкой служит пара оснований в ДНК, соответствующая нуклеотиду, который первым включается в транскрипт, синтезируемый РНК-полимеразой (другими словами, это нуклеотид, определяющий включение в мРНК инициирующего нуклеотида).
Как правило, он занимает строго определенное положение, но иногда может быть представлен двумя соседними основаниями, а в некоторых случаях любым из нескольких близлежащих оснований. Для определения стартовой точки необходимо исследовать 5'-конец первичного транскрипта, непосредственного продукта РНК-полимеразы, раньше, чем с ним произойдут какие-нибудь изменения. Наиболыпее количество информации о стартовых точках можно получить в опытах тп уйго, так как ш Иуо очень трудно выделить первичный транскрнпт, прежде чем он начнет деградировать (в случае прокариот) или подвергнется модификациям (у эукариот). На рис. 11.2 приведена схема универсального метода идентификации стартовой точки с использованием гибридизации транскрипта с его ДНК-матрицей. Суть метода ерччдОрфыыьуоаоочрчреоооооччророртз: тожчаож тржчжжюоа К1 — —— з Промотор1 Терм кетор ! Ряс 11.1. Траяскриппвонвой елиияпей является последовательность ДНК, считываемая с образованием спиной молекулы РНК, начинающейся на промоторе и заканчивающейся иа терминаторе.
Часть Н1. Синтез РНК 140 Денвтурецня а абрвювен ем Рнк.нрааукг — — ЛЖ тль Зеогх — —— дегрвдввнн аднааеначечнмх аб яства под аотсгвнем нукяевзь 5 \ Ьбз'ЭОЭСООбобсбцбХ г | Дегрвввенн РНК 1нварнмер, еад яысгвнемтаееочн1 Онреаелвнне еаснедоввтеньнастн ли мднК Рис. 11д Местоположение стартовой точки можно определить, сравниван образовавшуюся РНК с ДНК-мвтрнцсй.
При гибридизации РНК с денатурированной ДНК образуется гибрид РНК ДНК, в состав которого входит матричиа» цепь. Другая цсю ДНК остается несцаренной. Обработка нуклеазой ЯК сцецифнчески рас- состоит в том, что подвергают деградации всю ДНК, не гнбриднзовавшуюся с РНК, а затем определяют последовательность сохранившегося участка ДНК. У бактерий 5'-конец РНК идентифицируется однозначно благодаря наличию трифосфата. Выделение мРНК зп утуо затрудняется ее нестабильностью, но в случае рРНК и тРНК часто оказывается возможным блокировать процессинг первичного транскрипта 1являющегося предшественником зрелой РНК) и таким образом идентифицировать 5'-коиец, Клонированные гены можно использовать в качестве матрицы при транскрипции зп уггго, что в результате дает возможность изолировать образующуюся РНК и с ее помощью точно локализовать соответствующий участок в ДНК.
Некоторыс гены были исследованы как зп угуо, так и зп И1го, и при этом определение стартовой точки дало одинаковые результаты. Это придает уверенность в правильности получаемых результатов в тех случаях, когда информация ш уьуо недоступна и для идентификации стартовой точки используется только система ш уйго. У эукариот предшественник мРНК кэпируется вскоре после инициирования транскрипции, и поэтому тп угуо невозможно выделить молекулы, сохранившие первичный 5'-трифосфатный конец.
В реакции кэпирования в качестве субстрата используется 5'-три- или 5ьдифосфат, Из этого можно сделать вывод, что сайт кэпирования соответствует истинной стартовой точке. Этот вывод нашел подтверждение в опытах по транскрипции ш у11го. Оказалось, что во всех исследованных случаях первое основание траискрипта соответствует нуклеотиду, к которому зп у)уо присоединяется кэп. щепляющсй одноцеоочечную ДНК, гидролизует «ак несцареиную цепь, так и обдасти матричной цепи за пределами траискриоциониой единицы. РНК монет быть удалена из гибрида РНК вЂ” ДНК. Дю~ее можно ооределить цоследоватсльность ДНК нли, зная ес длину, локализовать местооозюиение РНК на ма~рице.
Исходя из этого, стартовые точки для РНК-полимеразы11 локализовали, идентифицируя те послеловательности ДНК, которые соответствовали стартовой точке мРНК, образующейся зп у1уо. Поскольку транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой1 1РРНК) и РНК-полимеразой111 1малые ядерные РНК и тРНК) не копируются, можно выделить молекулы, содержащие 5'-трифосфатный конец.
Это позволяет однозначно идентифицировать стартовую точку, которая используется гп угуо 1некоторые маленькие ядерные РНК кэпированы и поэтому не могут быть исследованы аналогичным образом). В органеллах процесс кэпирования не обнаруживается, и, следовательно, в принципе здесь нет препятствий при идентификации стартовых точек для всех видов митохондриальных и хлоропластных РНК. Сайт СВяЗЫВаНИя РНК-ПОЛИМЕраЗЫ Е. Суза Прочные участки связывания, на которых РНК-полимераза 1голофермент) образует стабильные инициирующие комплексы, располагаются внутри промоторов. Эти последовательности ДНК могут быть получены с помощью методики, приведенной на рис. 11.3.
Как показано на рисунке, РНК-полимераза 1и у11го взаимодействует с матрнцей, содержащей определенную транскрипционную единицу. Затем с помощью фермента ДНКазы гидролизуют все участки ДНК, не защищенные РНК-полимеразой. Образующиеся фрагменты варьируют по длине от 41 до 44 пар оснований. Фактически полимераза может ини- 11. Промоторы: сайты инициации транскрипции 141 циировать транскрипцию непосредственно на экранируемом фрагменте. В результате синтезируется короткая РНК размером 17 — 20 оснований. Синтез этой РНК оканчивается, когда полимераза достигает конца фрагмента. Это показывает, что защищенный фрагмент является последовательностью, иа которой инициируется транскрипция, а стартовая точка располагается примерно в середине этого фрагмента, ДНК, предшествующая стартовой точке, называется последовательностью, расположенной против хода транскрипции; ДНК после стартовой точки )которая образует транскрибируемую последовательность) называется последовательностью, расположенной по ходу транскрипции.
Последовательность ДНК принято записывать так, что транскрипция происходит слева направо. Это соответствует обычному написанию мРНК в направлении от 5'-конца к 3'-концу, Часто последовательность ДНК записывается только для той цепи, с которой транскрибируется РНК. Положения оснований нумерую гся в обоих направлениях, начиная от стартовой точки, которую обозначают как + 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
