Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 62
Текст из файла (страница 62)
КОНСЕРВатИВНаЯ ПОСЛЕДОВатЕЛЬНОСТЬ В ТТРОМОТОРВХ Е. СОй Одним из путей конструирования промотора является, очевидно, сборка уникальной последовательности ДНК, способной создать сигнал для связывания РНК-полимеразы. Исходя из размеров бактериального генома, можно думать, что минимальная длина участка, достаточная для создания необходимого сигнала, составляет !2 п.н. Более короткие последовательности, вероятно, встречаются довольно часто (просто в результате случайных событий) и могут создавать ложные сигналы.
Последовательность из 12 п.н. не обязательно должна быть непрерывной. Так, если определенное число пар оснований разделяет две короткие постоянные последовательности, нх совместная длина может составлять менее чем 12 п.н., так как само разделяющее рлсслволние создает часть сигнала (даже если разделяющая последовительность не обладает никакой специфичностью). Были предприняты попытки определить характерные особенности ДНК, необходимые для связывания РНК- полимеразы. Для этого сравнивали последовательности различных промоторов.
Любая необходимая для связывания нуклеотидная последовательность должна присутствовать во всех промоторах. Такую последовательность принято называть консервативной. Однако в результате анализа большого количества промоторов Е. сой (более 50) была обнаружена удивительная особенность; среди 60 п.н., взаимодействующих с РНК-полимеразой, не обнаружено сколько-нибудь протяженной консервативной последовательности, иными словами, большая часть последовательности участка связывания может быть необязательной.
Но некоторые короткие участки внутри промотора, очевидно, являются консервативными. Они-то и могут быть теми сигналами, которые узнаются РНК- полимеразой. Обычно, но не всегда, стартовой точкой является пуриновое основание (А встречается в два раза чаще, чем О). По-вилимому, в более редких случаях, когда обнаруживается пнримидин, РНК-полимераза способна преодолевать трудность, связанную с включением этого основания в качестве иннциирующего нуклеотида, Для стартовой точки характерно то, что она находится в середине последовательности САТ, но консервативность этого триплета не настолько выражена, чтобы считать его обязательным сигналом. Против хода транскрипции от стартовой точки располагается область нз 6 п.н., которая может быть обнаружена почти во всех промоторах. Эта последовательность не является строго постоянной, но всегда имеет большое сходство с последовательностью ТАТААТ, которая часто называется блоком Прибиова.
Фактически как таковая последовательность ТАТААТ встречается довольно редко, но она является среднестатистической, или канонической, последовательностью, составленной из оснований, наиболее часто встречающихся в каждой позиции. Каноническая последовательность может быть предо~валена в следующем виде Тво Авв Цв Ам ввв Твв где цифрами показана частота (процент) встречаемостн оснований, наиболее обычная для данного положения.
Заглавные буквы используются для обозначения оснований, присутствующих в данном положении более чем в 54; случаев, а маленькими буквами †основан, не столь консервативные, но встречающиеся чаще, чем при случайном распределении. То положение, в котором не дается преимущества какому-либо основанию, обозначено как Х. Обнаружение этой последовательности позволило сделать важное обобщение. Стало понятно, что полезно рассматривать возможные регуляторные сейты в ДНК, имея в виду идеализированные последовательности, составленные из наиболее часто встречающихся оснований.
Среднестатистическая последовательность выводится на основе уравнивания всех известных образцов с получением максимальной гомологин, Для последовательности, которая выведена как среднестатистическая, каждое конкретное основание должно наиболее часто встречаться в своем положении (например, оно может присутствовать в более чем 60% случаев), причем большинство реальных последовательностей должно отличаться от среднестатистической на небольшое число замен — например, на ! нли 2. Степень консервативности каждого основания в определенном положении в некоторой степени варьирует. Если в состав рассматриваемой области включать основания, встречающиеся в небольшом числе промоторов, например в 40% случаев, то ее можно продолжить за пределы блока Прибнова.
Имеющиеся данные можно сум- 144 Часть 1П. Синтез РНК мировать следующим образом: А з Т о Т о Т з О з Н таз Аао тм Ам Ам Тзсо нр Бзок Проосазз Цифрами показан процент встречаемости наиболее часто обнаруженного основания; 1'1 означает, что в данном положении может находиться любое основание. Между блоком Прибнова и окружающими последовательностями существует вполне четкое разграничение. Если частота встречаемости оснований указывает на их важное значение для взаимодействий с РНК-полимеразой, то мы вправе ожидать, что высококонсервативный димср ТА в начале блока Прибнова и полностью консервативный Т в конце являются наиболее важными основаниями.
Прочие основания в блоке Прибнова, обладающие промежуточной степенью консервативности, вероятно, также вовлечены в процесс взаимодействия с ферментом. Следуюгцне несколько позиций, находящихся против хода транскрипции, имеют склонность быть обогащенными А -Т-парами, которые, возможно, способствуют взаимодействию, но не являются абсолютно необходимыми. Среднестатистическая последовательность блока Прибнова состоит исключительно из пар А — Т. Это наводит на мысль о том, что ее функционирование может быть связано с плавлением и образованием одноцепочечных участков. Для разрыва двух водородных связей в каждой паре А-Т требуется меньше энергии, чем для разрыва трех водородных связей в паре Π— С. Из этого следует, что для расхождения цепей в участке, состоящем из пар А — Т, требуется минимальное количество энергии.
В действительности же болыпинство блоков Прибнова, идентифицированных в бактернальных промоторах, содержат одну пару Π— С, поэтому в реакции плавления обычно расходуется больше энергии, чем то минимальное количество, которое возможно теоретически. Логично предположить, что среднестатистическая последовательность должна наилучшим образом выполнять функции узнающего участка. Однако окружающие основания также могут влиять на это узнавание. Например, две трансверсии от А-Т к Т-А могут компенсировать одна другую, создавая другую последовательность, в такой же мере эффективную, как и среднестатистическая. Поэтому бывает часто затрулнительно предсказать эффективность конкретной последовательности по сравнению со среднестатистической.
Центр блока Прибнова обычно располагается примерно на расстоянии 10 п.н. от стартовой точки против хода транскрипции. Поэтому иногда этот блок обозначают просто как положение — 10. В действительности положение гексануклеотндного участка варьирует от — 1! до — 5 или от — 14 до — 8, причем послелний интервал встречается чаще. Сходная последовательность обнаруживается в другом положении с центром около нуклеотндного остатка — 35.
Этот участок называется последовательностью — 35. Поскольку эта последовательность представляет собой часть той последовательности, которая должна узнаваться РНК-полимеразой, но собственно не входит в область прочного связывания, то иногда ее называют обзааснаыо узнавания. Эта последовательность-ТТОАСА; более детально она описывается так; Твз Тва Озв Ам Сва вав В исследованных промоторах расстоянис между положениями — 35 и — 10 варьирует от 1б до 19 п.н. Хотя реально, может быть, и неважно, какая последовательность находится между этими областями, ее размеры могут иметь критическое значение для того, чюбы взаиморасположение рассматриваемых участков соответствовало геометрии РНК-полимеразы. Делеции, уменьшающие промежуток до 15 п.но или вставки, увеличивающие расстояние до 20 и.
но снижают активность промоторов, в которых они возникают. Имеется ряд промоторов, не содержащих специальной последовательности в положении — 35 (это определяют по отсутствию гомологии). Однако обычно такие промоторы содержат расположенный рядом участок, который узнается регуляторным белком, способствующим инициации. Поэтому возможно, что регуляторный белок заменяет функцию положения — 35.
Но поскольку другие промоторы, в которых наблюдается такая же регуляция транскрипции, сохраняют положение — 35, наблюдасмая корреляция не абсолютна. Вероятно, положение — 35 в какой-то степени определяет эффективность, с которой РНК-полимераза узнает определенный промотор. Обнаружено также очень небольшое количество промоторов, лишенных положения — 1О. Таким образом, ни одна из консервативных последовательностей не является абсолютно необходимой для функционирования промотора.
Нам пока еще не известны все детали реакции узнавания, и сейчас мы с уверенностью можем сказать только одно: втипичный» промотор использует положения — 35 и — 10 для взаимодействия с РНК-полимеразой. Поскольку у ряда промоторов рассмотренные последовательности отсутствуют, можно предполагать существование других способов узнавания, однако, сколько существует таких механизмов и как они восполняют отсутствие среднестатистических последовательностей, пока не известно. Промоторные мутации, усиливающие и ослабляющие экспрессию 1снов Мутации в цромоторах, влияя на уровень экспрессии контролируемого гена (генов), который находится под их контролем, не изменяют кодируемых генами продуктов.
Большинство таких мутаций было обнаружено в результате выделения бактернальных мутантов, у которых способность к транскрипции смежных с промотором генов была либо совсем утрачена, либо находилась на очень низком уровне. Такие мутации называют ослабляющими. Реже обнаруживаются мутации, способствующие транскрипции, инициируемой с промотора. Это так называемые усиливающие мутации. Улнвительно, что оба типа мутаций могут возникнуть в результате изменений, затрагивающих только одну пару оснований.
Следовательно, взаимодействие РНК-полимеразы с этими участками в промоторе должно быть высокоспецифнчным. Рассматриваемое основание должно либо узнаваться ферментом, либо непосредственно участвовать в процессе инициации. (Очевидно, что мутации, ослабляющие экспрессию, могут возникать также в результате делеции более протяженных участков промотора.) Информация, полученная в результате экспериментов 1п т1чо, лишь указывает в целом на природу изменения, обусловленного мутацией. Чтобы проанализировать ее действие на молекулярном уровне, необходимо охаракте- 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
