Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 68

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 68)

Но возможно также, что энхансер обеспечивает расположение матрицы в определенном месте в клетке, например прикрепляя ДНК к ядерному матриксу. Существует еще одна возможность, хотя н менее вероятная,— энхансер непосредственно участвует в связывании РНК-полимеразы (после чего фермент начинает двигаться собственно к цромотору). В геноме ряда вирусов имеются элементы, несущие ту же функцию, что и 72-нуклеотидная последовательность вируса БЧ40, хотя они не гомологичны друг другу.

В пользу предположения о том, что эти элементы могут выполнять сходные функции, свидетельствует тот факт, что аналогичные компоненты генома ретровирусов могут заменять энхансеры в ДНК вируса оЧ40. Возможно, что эта часть ретровирусной ДНК вовлечена в активацию клеточных генов. К настоящему моменту знхансеры не были обнаружены в составе природных клеточных единиц транскрипцииу. Характер взаимодействия вирусных энхансеров с клеточными промоторами может быть различным, так как не все промоторы чувствительны к их действию. Например, транскрипция с промотора а-глобииовых генов не усиливается в присутствии 72-нуклеотидного повтора вируса 5Ч40.

Значение этих результатов очевидно. Нам необходимо соблюдать осторожность при определении элементов, составляющих промотор. Недостаточно только показать, что делеция определенной последовательности нарушает процесс транскрипции. Мы должны также установить, насколько важна локализация делегированной последовательности.

Итак, что же такое промотор? Если мы ис- ' В последнее время установлено существование знкансеров н целом ряде клеточных генов (генон нммуноглобупннон, инсулина н др.).— Прим. рва пользуем рабочее определение, согласно которому это последонательность или последовательности ДНК, которые должны опредеденным образом располагаться относительно стартовой точки, то под промотором надо понимать последовательность вокруг блоков СААТ и ТАТА.

Из этого определения становится ясно, что мы не вправе исследовать структуру промотора, просто делетируя отдельные его участки. При этом промотор может инактивироваться в результате изменения расстояний между его определенными областями, даже если сами делетированные последовательности и не играют никакой роли. Поэтому необходимо создавать маленькие делеции, на место которых помещались бы другие последовательности таких же размеров. С помощью такого подхода можно определить те последовательности ДНК вокруг стартовой точки, хоторые необходимы для инициации транскрипции. Промотор РНК-полимеразы 111 расположен в самой транскрипционной единице Во всех случаях, когда предпринимались попытки обнаружить промоторную последовательность РНК-полимеразы, предполагалось, что промотор окажется расположенным против хода транскрипции (считая от стартовой точки). Так продолжалось до тех пор, пока не был охарактеризован промотор для генов, кодируюших 5Я-РНК у Х.

1аеркс У этих генов, транскрибируемых РНК-полимеразой 1П, промотор расположен в пределах транскрипционной единицы на расстоянии более чем 50 оснований правее стартовой точки по ходу транскрипции. Такое его расположение объясняет отсутствие сколько- нибудь очевидных консервативных последовательностей в участках, расположенных слева от стартовых точек генов, транскрибируемых РНК-полимеразой 1П. Транскрипцию гена 5$-РНК, взятого в качестве матрицы в составе плазмидной ДНК, можно осуществить в ядерном экстракте из ооцитов Х. )аер)з, в которых этот ген экспрессируется в норме. В рассматриваемом случае местоположение промотора было определено при использовании рекомбинантных плазмид, у которых делеции распространялись внутрь гена, с обоих его концов, Оказалось, что синтез 55-РНК продолжается даже в том случае, если делетируется вся последовательность, расположенная перед геном.

Это означает, что промотор располагается не за пределами гена. Когда делеции захватывают сам ген, то образующийся продукт очень схож с обычной 5$-РНК. При этом синтез продолжается до тех пор, пока делеция не достигнет положения + 55. Образующаяся РНК состоит из двух частей. Проксимальная часть соответствует плазмидной ДНК, тогда как дистантьная часть представляет транскрипт с оставшегося участка, кодирующего 5$-РНК. Но хогда делеция захватывает позиции, находящиеся за положением + 55, это приводит к полному прекращению транскрипции.

Следовательно, промотор расположен справа от положения + 55, но при этом дает возможность РНК-полимеразе инициировать транскрипцию на более или менее определенном расстоянии от него. В гене дикого типа инициация происходит в строго фиксированной точке.При ее отсутствии инициация начинается с пуринового основания, ближайшего к положению — 55 и.

н. от промотора. 11. Промоторы: сайты инициации транскрипции 155 51 а 120 геа 55.анк млзеаоююаю;аоыааъъалзоаиежомвяожжъъза Рис 11 1О Все три гена для РНК- полнмсразы 1И содержат внутрсинис промо горы (участки, изображенные красным). Цифрами обозначены первые н последние оснонаниа в гене. а1 а 150 г игы лллложомъочллллларитлллалаохжммлммиллаллзлллммчлалллраомлллм и1 а 72 геа еанк, лор~~~дъаомеалзжлоалалоессочочло ин Когда делеция захватывает дистальную часть гена, транскрипция не нарушается до тех пор, пока проксимальные 80 п.н, остаются интактнымн. Транскрипция прекращается, если делеция затрагивает зту область. Таким образом, правая граница промотора, расположенная по ходу транскрипции, находится около положения + 80.

Поэтому промотор для транскрипции 58-РНК находится внутри самого гена между положениями ч- 55 и + 80. Фрагмент, содержащий эту область, способен осуществлять инициирование транскрипции любой ДНК на расстоянии 55 п.н. перед сайтом своей интеграции. Каким же образом РНК-полимераза инициирует синтез РНК в области, предшествующей расположению своего промотора? Наиболее предпочтительное объяснение состоит в том, что размеры фермента позволяют ему одновременно связываться с промотором и взаимодействовать с областью, отстоящей от него на расстояние 55 п.н. Так же как и в случае с РНК-полимеразой П, геометрия связывания фермента с промотором должна определять местоположение стартовой точки, но пирнмнднны при этом не могут быть использованы при инициации.

Поэтому фермент обладает некоторой свободой прн выборе ближайшего пурина, участвующего в инициации. Конечно, между ферментами существуют различия; так, РНК- полимераза П )устанавливает контакт с точкой старта, расположенной от йромотора по ходу транскрипции, тогда как РНК-полимераза П1 связывается в противоположной ориентации (при условии, что промотор является местом связывания). Все лн промоторы для РНК-полнмеразы ГП находятся внутри транскрнпцнонных единиц? Границы некоторых из них указаны на рис. 11.10. У гена УА1-аденовирусов промотор расположен между положениями + 9 и + 72.

Делеции, затрагивающие эту область, приводят к потере активности гена. В случае гена, коднрующего синтез тРНК, у Х. )пер)з, промотор располагается Мее в двух отдельных областях, лежащих внутри гена. С помощью делеционного картирования были определены координаты этих областей, находящихся на участках от + 8 до + 30 и от + 51 до + 72 Любая деления, уменьшающая расстояние между ними, нарушает инициацию, но изменения в участке между ними нли вставки, увеличивающие расстояние между этими двумя областями (вплоть до 30 п.

н.), не оказывают никакого действия. Таким образом, промотор состоит из двух отдельных областей размером около 20 п.н. каждая, которые должны быть разделены расстоянием минимум в 20 и. н. У ряда других генов для тРНК обнаруживается похожее строение промоторов. В эукариотических тРНК последовательности этих областей высококонсервативны. Ранее данный факт интерпретировался исключительно с точки зрения функции молекулы тРНК. Но сейчас установлено, что такая консервативность может быть объяснена необходимостью сохранения промоторных последовательностей.

В связи с локализацией промотора во внутренней части гена возникает принципиальный вопрос. Когда промотор располагается с внешней стороны транскрипционной единицы, то он способен эволюционировать независимо, удовлетворяя лишь потребностям ферментов. Но последонательности ДНК, необходимые для инициирования транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой П1, должны отвечать условиям, диктуемым структурой довольно различных сннтезирующихся молекул, таких, как тРНК, 5Я-РНК, УА РНК и малые ядерные РНК.

Как же эти последонательности обеспечивают все необхолимое лля взаимодействия с РНК-полимеразой П1? Одна из возможностей состоит в том, что фермент способен узнавать широкий диапазон промоторных последовательностей. Это не кажется невероятным, если учесть, что в промоторах, узнаваемых РНК-полимеразами других типов, консервативные участки очень малы по размеру. Возможно также, что фермент самостоятельно не способен узнавать промотор, а нуждается для этого во вспомогательном факторе.

В этом случае необходимо существование различных факторов для каждого типа промотора. Действительно, оказывается, что РНК-полимераза П1 способна транскрибировать 1ены, кодирующие 58-РНК, только в присутствии вспомогательного фактора. Это белок с мол. массой 37000 дальтон, взаимодействующий с участком от + 45 до + 96. Данный белок (несколько копий которого должно связаться с ДНК, чтобы покрыть столь обширную область) одновременно служит двум целям, поскольку в ооцитах он также связывается с образонавшейся 58-РНК. Рассматриваемый регуляторный белок не связывается с ДНК, кодируюшей тРНК, с. Мы можем предположить, что в дальнейшем будет охарактеризован ряд аналогичных факторов, играющих важную роль в селекции промоторов.

Одна молекула белка связывается с регуляторной областью, образуя «преиницнаторный комплекс» (в состав этого комплекса входит также белковый фактор, необходимый для транскрипции всех генов класса П1). Наличие такого комплекса служит сигналом, сообщающим о зом, что ген находится в иактивномо состоянии н может быть транскрибирован. РНК-полимераза способна связаться с геном только при условии, что предварительно с ним связался белковый фактор.

Характеристики

Список файлов книги