Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 42
Текст из файла (страница 42)
СЫ ра ПЦЭ' ааС'" Гснб ра р гена ! Субъелинваы а(С ) б сэувкциас сальнъсй вехах аб Рис. 7Д7. Двухцисчронный зкспресснрующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодирусот субъединицы химерного белка (а))). Они разделены сегментам ДН К, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рнбосом. Каждый ген находится нол контролем эукариотических промглора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).
с рансляция мРНК начинается с 5"-конца и с внутреннеп> сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъелиницы объединяются с обраюваннем функционального димерпого белка. Вектор содержит сайты инициации реплнкации, функционируюпсие в Е. сол (агй) н в клетках млекопитающих (огрс ); селективный маркерный ген (Аюр') для отбора срансформированных клеток Е. со!с; селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукарнотических нромотора (р) н сигнала пслиаленилирования (ра).
злк)иочкник Прокариотические системы экспрессии успешно используются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические посттрансляционпые модификации — гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому было решено попьггаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариотических экспрессирунлних векторов. Для синтеза разнообразных белков, копируемых клонированными генами, использовались дрожжи Х сегесс(з)ие. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах.
Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью 5. серег)з1сге было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе це подвергались посттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбннантных белков. В поисках других эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно бьцю бы получать биологически активные белки, исследователи сосредоточили усилия на создании экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов, в частности бакуловируса АсМХРУ, инфицирующего клетки многих насекомых. Исходная стратегия предполагала трансфекцию клеток насекомого, зараженных АсМ)~РУ, транспортным вектором, который содержал клонированный ген, фланкированный АсМ'МРЪ'- специфичными последовательностями. В результате двойного кроссинговера между вектором и геном АсМ)ч)Р)с' клонированный ген вщраивался в последний и попадал под контроль силыюго цромотора.
функционирующего на последних стадиях литического цикла. Клетки насекомого, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, синтезировали гетерологичный белок. Получение рекомбннантных белков с гюмошью эукарнотнческнх систем 155 т1астоту появления рскомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК АсМ1ч РЧ обрабатывали энлонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литичсского цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором.
В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном АсМХРЧ, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литичсского цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. Следующий шаг в усовершенствовании системы экспрессии на основе бакуловирусов состоял в создании бакмиды, челночного вектора Е сай7клетки насекомого, позволяюгцсго проводить все генноинженсрныс манипуляции в Е. сай. Клетки насекомого трансфицировали рекомбинантной бакмндой только с целью получения гетерологичного белка.
Примерно 95% гстсрологичных белков, синтезированных в системах экспрессии на основе бакуловирусов, имели соответствующие посттрансляционные модификации. Внехромосомпые экспрессируюшис векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гстсрологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Ть са!г-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из гсномов млекопитающих. Для отбора трансфипированных клеток используют доминантныс сслективныс маркерныс гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цнтотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие болыпое число копий вектора, что увеличивает выхол чужеродного белка.
Разработаны системы экспрессии млекопитающих, позволяющие получать белки, состоящие из двух разных субъединиц. Для этого хо- зяйские клетки трансфицировали сразу двумя векторами, каждый из которых нес ген одной из суГгьединигь Альтернативный подход состоял в использовании одного вектора, который нес эти два гена в виде отдельных единиц транскрипции или в виде одного транскриптона, солержашего оба этих гена. ЛИТЕРАТУРА Сос!ге1! М. 1„С. К. Вег!д!п8!оп, б. Т. Ъ'аггап!оп. 1990. Н18Ь!ече1 схргеагйоп оГ йаапе 1пЫЬ11ог ог тегайоргогешавев !п СЫпеае Ьашагсг очагу сейк пкйз8 81пгапз1пе купгйегаае 8епс агпрййсаВоп.
Вю/?ес1гпа1ару 8г 662 — 667. Со!е Е. Я., К. !ее, К. Еапх!еге, С. Кейоп, Я. СЬарре1, В. чте!пггавЬ, !3. Реп ага, Р. Ре1егаоп, К. Вегпаасогг1, Т. Ег!шппг1в, В. К1сйагг!а, !.. 11!е!ггей, 1. М. К!еегпап, Л. Н. МсРЬегаоп, В. М. Ргайч 1993. КесопзЬшапг Ьшпап ГйугоЫ зГ!шп1аГ!гз8 Ьоггпопс: г1ече1оргпепГ оГ а Ьюгес1зпо!ойу ргог!псГ 1ог дссесГ!огз оГ гпещвГаГк 1саюпа оГг!зугогй сагсгпопза. В1о/Тесйла!ору 11г 1014 — 1024. Сге88 Л.
М., Л. К Тасйорр, С. ЯП!Ьпап, К. Яейе1, М. А!гоп8, 'чУ. Я. Сга!8, К б. ВпсИю!к, К. К. МагЫеп, Р. А. Кейапа, С. К. 13ач!в, В. 1,. Байеу, Л. Спгге, К. Тогтейгоава, б. Чейсе!еЫ, С. Р. ТЬ!П. 1987. Нг8Ь-!еъс! схргеааюп апс! сйюкпГ акаспгЫу оГ ЬераГгйа В апгГасс апййеп !и ГЬс гпеГЬу1оГгорЫс уеааГ, Ркй1а рагцапк Вю/Тесйпа1айу 5: 479 — 485.
Тгач1еа А. Н. 1994. Сштепг пзсгЬода 1ог пзапгрп1аг!п8 Ьасп!оч!гпв. Вю/Тесйпа!а8у 12: 47 — 50. Р!8ап М. Е., Я. Ч. !лг1г, К. А. Впег1еу, К. Ь. Яейе1, М. Е. ччййаша, Я. В. ЕПЬ, Р. А. КейагЬ, Я. А. Рппое., 5Ч. Я. Сга18, б. Чейее1еЫ, М. М. Нагро!й, С. Р. ТЫП. 1989. Сопйппопа ргос1псйоп оГ а почс! 1уаокуше ч!а аесгсйоп Ггош гйе Усам, РЬГйа Рак!ау!к В1агг7ес1гпа1а8У 7г !60 — 164. Т11г1га чт'., М.
зт1гГЬ, И. Напаег. 1993. О!с!з!гоп!с ггапаспрйоп ппйк 1ог 8епе схргсввюп 1и гпагпгпайап ссйа. Селе 128: 247-249. СейЬаеп б., Х. А. Лапоп!сх, П. 'туеудегпапп, К. Ме! Ьег, А. 59. М. В!гаааег, С. Р. НойепЬег8. 1992. НгпЬ-1ече! ехргеакюп оГ Гоге!ко йепев 1п 156 ГЛАВА 7 Напяепи!а ра(утогр(га. В!о(ес(гпгг(, Аг(ч. 10: 179 — 189.
б!8а-Наша х'., Н. Тоййа, Н. О)гайа, М. К. О»ада, Н. О)гауаша, Н. Кивайай 1994. Н)8Ь-!ечс! схргсььюп оГЬип1ап Иросогйп 1!и Гйе йягйоп уеая! 5с(г(яовасс(гагатусея рот(ге игйп8 а почс! схргевгйоп чсс1ог. В!а/Тес1то!оку 12: 400-404. бйЬег1 Я. С., Н. чап ()гй, А. Л. бгеепйеЫ, М. Л. МсАчоу, К. А. ))еп!оп, Г). Сой)аа, б. О. Липея, Г).
Л. Меам. 1994. 1псгсаве 1п сору пшпЬег оГ ап )п)ейгагег) чес1ог дийп8 соп)шиоиь си1)иге оГ Напяепи(а ра!утогр(га схргеьв)п8 Гипс!юла! Ьишап Ьегпо8)оЬ)п. Уеая( 10: 1569-1580. ТЬе б)оЬа1 1(яе оГ Б)га)ей)ев )о Ореп Осс)идей АггеПев (бЮЯТО) НЬ )пчевййа!огя. 1996. А сошрапяоп о(гссогпЬ!пап))йгисйп»ч1Ь Ьерапп Гог Гйс ггса)шеп) оГ аси)с согопагу ьупг)гогпся. й(.
Еп81. Х 1)(ег(. 335: 775 — 782. Найс»ей К. А., К. Мй!я, Р. Те)гашр-О)воп, К. В1асЬег, Я. КояепЬег8, К О(йп8, К К. Маяигг, С. Л. Ясапг)ейа. !987. Анино гегш)па! асс)у!а)юп оГ ашЬепйс Ьшпап Си, Уп вирегох!Ве гйвпш)авс ргог)иссг) ш усавй В(о/Тес(гпо(осу 5: 363-366. К)44 1. М., )г. С. Евегу. 1993. ТЬс ияе оГ Ьаси)оч)гизев ав схргеввюп чсс)опк Арр!.
В(ос(гет. В(а(ес(ггго(. 42: 137 — ) 59. К1йя Р. А., К. Г). Рояяее. 1993. А гпе)Ьог) Гог ргог)ис)пц гссопзЬ!пап! Ьаси)оч)гия ехргскя)оп чесюгь а! Ь)8Ь Ггег)пенсу. В!оТсс(гп(г(иев 14: 810 — 817. Глгосйе 1'., тг. Ягоше, Л. 1)еМеиггег, Л. Меяяепя, М. Еаизчегеуя. 1994. Н!8Ь-)ече1 ьесгейоп апг) чсгу срйс)сп! гво1ор)с )аЬе)и18 оГйс1г апйсоайи1ап) рерг)йс (ТАР) ехргеявсг) !и Гйе ше)Ьу1о)гор)йс уеая1, Р(с(г!а рая(опк В(а/Тес!ит(оху 12: 1! 19 — 1124.
).о)яоп б., А. Р)идей, Я. Вегпагд, М. ХйиуепЛирисев, М. Магг)ие1, Х. К1еЬ)-Вейоп, Г). Сагчайо, Г,. биегга-Яап)оя, В. чч'. Вго»п, М. Соиг)псу, С. КойясЬ, т'. ).ево)пе. 1988. Ехргеьяюп апг) яесге1юп )и 5'. сегеч!в(ае оГ Ью1орсайу ас)гчс 1сссЬ )нгигйп. В(а/Тсс(гпа(оку 6: 72 — 77.
) исая В. К., 1,. М. б!его, К. А. Г)еМагсо, А. Я~еп, ')г. СЬ)яйо)ш, С. зч'. Сго»4еу. 1996. Н)8Ь-!сче) ргодисйоп оГгесошЬ)пвпг рго)е)пь )п СНО сеИь ивйп8 а гйс)в)гоп!с ГэНГК )п1гоп ехргсяя)оп чесгог. Хис(е(с Ас(г(в Вея. 24: 1774 — 1779. Еис)гпо» ч'. А.„Я.
С. ).ее, б. Г. Вагту, Р. О. Ойпя. 1993, Ей!с)еп! 8епегайоп оГ гпГесйоиь гесопзЬ)- пап! Ьаси)очзйиьсв Ьу г41е-вресрйс ггапвровопшсгйагег) гпвсг)ю)п оГ 1огс)8п 8епсв )пго а Ьаси)оч)гия 8епогпе ргорайа1ег) ш Еясйег(с(г!а со1г. У. )'(го(. 67: 4566 — 4579. Репй Я., М. ВошвегГей, Л. Еойап, 7.. Ниапй, Т. Лййпй, К. К)г)г, Е. Нип1ег, Е.
Яогвсйег. 1993. Опе-в)ср айгпйу Во1айоп о1' гесошЬгпапт ргоге)п игйп8 Гйе Ьаси)очния()пьес) ехргевв!оп вуьгсгп. Рго(е(п Ехрг. Рш ф. 4: 95 — 1ОО, КоЬшяоп А. Я., ч'. Н!пся, К. Г). %йг)гир. 1994. Рго1е)п гйви!Вг)е )вошегавс очегехргеья)оп !псгеавев ьссгс1юп оГ Гоге)йп рготешя )п Загсваготусев сегеч(я(ае. В(а/Тсс(гпо!оку 12: 381 — 384.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
