Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится вес начинать сначала, синтезировав новый набор «вырожденных» праймеров, комплемснтарных другой области гена. !б4 ГЛАВА й Праймер с единственным отличающимся нуклеотнаом Обозначения Г Прайл~ер ПоследовательностьЕЛ мишень вв Исходный нуклетнл Исхолный нуклеотид ППР Цепь 1 Неспарнваюшийся нуклеогил Цепь 2 Цепь 3 Аяплнфицяравацная линейная ДНК ~атурапня :имен Цепь ! Цепь 4 Цепь 3 Цепь 2 Разрыв Разрыв Кольцевая плазл~идная ДНК с гиноцепочечнымн разрывамн и измененной нуклеотивной парой Кольцевая плазм ялная ДН К с олнопецочечными разрыва и измененной нуклеотндной парой я Рй сов Мугантные плазмилы Рис. 34.
Олигонуклеотил- направленный мугагецез с использованием П 1!Р. Реакцию проводят в лвух пробирках, в каждой из которых содержится олинаковая двухцепочечная плазмилная ДН К, но разные наборы праймеров. Праймеры ! и 3 содержат один неспаринающийся нуклсогил и комплементарны разным цепям плазмидной ДПК. Праймеры 2 и 4 полностью комплсментарны соответствующим участкам плазмилной ДНК и тоже гибрилизуются с разными цепями. Положение сайгон гибрилизации лая праймеров кажлой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦ!"-амплификации образуются линейные молекулы.
По окончании реакции солержилюе пробирок смешивают и проволят ленатурацшо, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исхоггных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочсчными разрывал1н. После трацсформации кольцевыми молекулами клеток Е соб разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмила может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. го6 не сохраняются. Нанравлсшн <й мупненез и генная инженерия белков 165 ° ° > Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов основе фага М13: эффективный универсальный метод внесении точковых мутаций в любой фрагмент ДНК М.
). Уо!!ег, М. Бгв!!й Л>а<.ге!е Ась х Ле>. 10: 6487 -6500. !982 вносить в нее мутации. К сожалению,этогилругие л<ещаь<олнгонуклеотил-направленною мугюенеза требовали лля своею применения специальных навыков и вначале иримсн>иись только з веско><ьких научно-исслслоывельских лабораториях. Позхол, рал>зботзннь<й По< ысрсм и Смнюм, позволял <иносительно просто, специфично и бь>стро вносить мутапии в лсбой клонировзнн<лй ген и сразу жс получи> н<н!юкос распространение П ею основе лехоп использование Фага М13 Е. <ой. Чужеролну>о ДНК вс>раивакв в лвухцепочечнук> реплика> ивную Форму боговой ДНК, к олноцепочечной ДНК лобавлякл олигонуклсотил с необи>лимыми заменами, полгию< му>антнук коцнк> ДНК, а за>ел> мупвпну цепочсчную Форму.
Впосле >па метолика бьиз существен вери <енствовапа и упроще<м пслкюваласьл«я нанравленн пивце>а тысяч раз«ых генов литоиуклеотил-наиравзюнеза (сайт-специфигенеза) была разраГютаном в лабораз.ории М. молификация л<сниа >рксра.. 1!ри лег>звании у>вцик> в Фзгсвой ДНК гюл<ощью о<жгла л<у- К с Фра< ментом компле- ДНК ликого типа. Было то, <яжг<гэя химически тнн<яй олиго! <уклывил с НК л<ожио, напротив, 94%С 296 Л 2<6 С 2% 1 Ос<4>орало>лг>ть !00% А 1009е С 100% 1' Сг ахи> о 2%Л 2%С 2%т л о 2%Л 2%С 2% Г С Т С А А 2%С 2%Т Частично вырождениые олигонуклеопщы могуг бьгп встроены в <сн-мишень разными способами.
Один из полхолов состоит в следующем. Гоп встраивакгг в плазмицу между двумя уникальными сайтзми ресгрикции и провояят влцшификапию его левого и правого псрскрьпиющихся между собой фра>ментов при помощи нескольких ПЦР(рис. 8.б). Пара прайл<еров, которая нсполгиустся гц>я амплификации левого фрагмента, вк<ючаст непоаносп ю комплсмептарный олигонукаеоищ, снаригик>щийся с тяжелоЙ цепью т:на-ми!испи, и обычныЙ, полностью комплемсн<арный праймер, гибрилизую<цийся с участкол! легкой цепи„фланкирующим левый уникальный сайт рсстрикпии.
Один из праймеров, используюшихся Лля амплификации правого фрагмента, сопержит нскомплсментарныс нуктеотилы и спаривается с тяжелой цепью гена-мишени, з второй праймер полностью комплементарен участку легкой цепи, фланкирук>шему второй (правый) уникальный сайт рестрикции. Пролукты ПЦР-амплификапнн очишак>т и обвели няют, а затем полвергают лснатура пни и рснатуриции. В результате образуется некоторое количество частично лвухцспочсчных молекул ДНК, спаренных в области гена-мишени. Их Лес>раина<от ло полностью лвухцепочечныхс помощьюДНК-полимеразы, а зятем проводят ПЦР-амплификацию с парой праймеров, комплементарных противо- Рис.
8.5. Химический синтез слигонуктео<илных праймсров. совержа<лих в опрслелснных сайтах ра>- ные нуклеотилы. В ванном случае в сосуле с О-Фос<йоралв<литом (94%) содержатся также Фосфорал<илг<ты А (2%), С (2%) и Т (2%), так что в результат~ реакции обра>устоя смесь олигонуклеотилов, в которых в тех сайтах. гле лол>кен нахолиться С>, присутствуют А, С или Т. ! бб ГЛАВА 8 Сват ресзрикции В Сват рвстрикпип А Синтез ~ левого фрагмента Синтез правого ф>>м.мв птв | Оч ишка, Ленвтурвцил.
Рснлзурапия | Расщепление рввтриктвзами А и В положным концам молекул. Амплнфицнрованные молекулы обрабатывают двумя эндонуклеазами рестрикции, уникальные сайты которых находятся на концах фрагмента, н встраивают в соответствующий цлазмндный вектор. Этот подход позволяет получить измененные гены со сл> >айнымн мутациг!ми.
Случайнь551 мугдагенез с аснальзованиелг аналогов нуклеагдадое Помимо методов внесения мутаций в клоннро- ванный ген, основанных на ис>тользованг>и фа- га М13, были разработаны другие подходы, в Рис. З.б. Случайный му5агецез с использованием «вырожденных» олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отлельности с помощью ПЦР, Соответствуюп5ие праймерь5 показаны гори:юнил ьи ыми стрелками.
вйырожденныел олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотилу, пе комплементарному соответствующему иую5еотилу в гене-мишени. Амплифицированныс фрагменты очищают, лснатурируют до полного разлелсния цепей и ренатурирукп. В результате образуются частично двухцепочечныс молек>ль5 ДИК, спаренные в области гена-мпц5ени.
Их достраивают с помощью Дг!К- полимеразы н проводят ПЦР-амплификапию. ПЦР~ролукты расщепляют эндонуклеазами рестрикпии А и В и встраиваюг в вектор, обработанный теми жс ферментами. которых использовались плазмидныс ДНК. Одни из них схематично представлен на рис. 8.7. Гс>5-мишень вс>Вливают в 55лазмиду поГ>55>лзостн от двух тесно расположенных сайтов рестрикции. Эти сайть> подбирают так, чтобы после расщепления двумя рсстриктазами образовывались укороченные 3'- и 5'-концы, а именно, чтобы 3'-конец сайта расщепления„ расположенного рядом с клонированпым гсном, был укорочен, а 3'-конец с другой стороны плазмнды выступал. Экзонуклевза 1П (Ехо(11) Е соб расщепляет молекулу ДНК только с укороченных 3'-копцов, Направленный мутагенез и генная инженерия белков >67 Клонироаанпый геп ДЕ! КЕ2 3' Расщепление е помощью Ехо! П 5' б>рагмент ! 4 д>4ТР, Кленова ~ ! аналог д)ЧТР(ей) 3' 5' Включившийся аналог д>ЧТР Нукаеааа Б! ~ Лигаза Трансформация Е год Мугантнаа пара нуклеотилоа но не с выступа>ощих 3 — или любых 5'-концов.
Ее добавляют в реакционну>о смесь после инкубпрованния ДНК с двумя рестриктазами, и она отщепляет от укороченного 3'-конца цепи по одному нуклеотиду. Через определенное время реакцию останавливают и заполняют пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы ), используя смесь обычных четырех дезоксирибонуклеотидов с добавлением аналоги одного из них. В результате получают плазмиды, содержащие ген-мишень, в одном или нескольких сайтах которого находится аналог соответствующего нуклеотида. Имн трансформируют клетки Е.
со)>. Плазмиды реплицнруются, и в клонировапный ген вкл>очается нуклеотид, отличный от такового в нсходцом гене. Помимо описанного выше, для случайного мугягенеза испол>пуют н другие методы, например один из вариантов олнгонуктеотид-направленного мутагенеза с применением ДНК фага М ! 3. В этом случае затравкой для синтеза ДНК служит смесь олигонуклеотидов, содержащих случайные замены. В результате получают библиотеки ююнов, несущих множество мутаций в различных сайтах. Недостаток подходов, при которых в клонированном гене образуется большое *>исло случайных мутаций, состоит в необходимости тестирования каждого клона для идентификации того, который детерминировал бы синтез нужного белка.
Это весьма непростая Рис. Я.7. Внесение случайных мутаций в клонированный ген. Вектор. несущий клонированцый' ген, расщеплякн рестриктазами КЕ! и КЕ2, в результате чего образуются один 3'- и один 5'-укороченные концы (и соответственно один 3 - и один 5 -выступающие концы). Затем его обрабатывают ферментом ЕхоИ), который расщепляет ДНК только с укороченного 3'- конца, удаляя пп олпому нуклеотиду.
Через некоторое время реакцию останавливают и заполняют образовавшийся пробел с помощью фрага>енав Кленова ДНК-полимеразы ! Е. го>Е При этом в реакционную смесь доба вляк>т все четыре лезоксннуклеозидтрифосфата (дХТР) н в небольшом количестве— аналог одного нз них. Обрабатыва>от продукт нуклеазой Я ! лля образования тупых концов, лигиру >от с помощью ДНК-лигазы Т4 и трансформируют клетки Е. ео)>, При последукипей репликации векторной ДНК в комплементарную цепь вклизчаются нуклеотиды, отличные от исходных, в том сайте, где находится аналог нуклептила.
В результате в клонирпванпый ген вносится мутация. Обрабгпка двуми Укороченный 3 -конец эплопукаеазал>и~ Г Укороченный рестрикции у 5 5'-конец !68 ГЛАВА 8 Генная инженерия белков На долю 20 из многих тысяч изученных и охарактеризованных ферментов приходится более 90% всех ферментов, используемых в настоящее время в промышленности.
В табл. 8.1 перечислены некоторые наиболее важные из них и указана область их применения. Остальные ферменты цс используются потому, что присущая им активность не уяовлетворяет требованиям, 55ре5гьявляемым вьюокоспециализированными процессами, протекающими ш ч!!То. Большинство ферментов быстро лепатурируют при высокой тслпзсратуре и в присутствии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
