Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 40
Текст из файла (страница 40)
7.11) С помощью этой системы доля зон лизиса, содержащих рекомбинантные бакулови- русы, была увеличена до 99%. Создание челночного вектора ла основе бакулавирусав для Е. сой и клеток насекомых Разработана система, позволяющая осуществлять все генноинженерные манипуля>1ии по созданию экспрессирующсго вектора на основе бакуловируса в Е. со!6 При этом трансфекция клеток насекомого нужна только лля синтеза рекомбинантного белка. В системе используется фрагмент небольцюй плазмиды Е, со!1, фланкированный участками ДНК, расположенными с 5'- и 3'-концов гена полнэдрина. Он содержит ген устойчивости к канамицину, нукчеотидную последовательность, играющую роль сайта интеграции и встроенную в ген 1г>сУ без нарушения его функции, и сайт инициации репликации, активный в Е.
сел. Интеграция плазмиды в геном АсМ)Ч Рт> происходит в результате двойного кроссинговера и сопровождается элиминацией гена полиэдрина (рис. 7.12, А). При этом образуется кольцевая ДНК, способная сушест- На первый взглял разработка любой эукариотической системы экспрессии представляется относительно простой процедурой, состоящей в подборе соотвегс>вуюших регуляторных послеловательностей, вс>раивании их в вектор в определенном порядке и клонировании гена-мишени таким образом, чтобы обеспечивалась его эффективная экспрессия. На практике же создание первого поколения эукариотических экспрессирующих векторов оказалось весьма кропотливым делом, основанным на методе проб и ошибок.
До появления рабсгь> Муллигана, Хоуарда и Берга мнению авторов сзатьи, «основное новшество состояло в решении оставить неизмененной область вектора, участвующую в ...процессинге мРНК,» Это исследование показало, что эффективную эукариотичсскую систему экспрессии можно создать, поместив ген-мишень вод контроль транскрипционных и >рансляционных регуляторных последовательностей. В ходе дальнейших экспериментов были установлены все структурные особенности, которые должны быть присущи эукариотическим экспрессирующим век горам.
Получение рскомбинантных белков с помощью эукариотическнх систем 147 Модифицированный бакуловирус Ген 603 Ген пспиэлрина Ген, необходимый лла рапликации Транспортный асктср Рсксмбииантиый бакулонирус Гсп 603 Клони!юаанный ген Гсн, нссбхолимый лля рспликацаи аовать в Е сод как плазмипа и ответственная за образование в трансфнцнрованных клетках насекомого бакуловирусов.
Челночные векторы на основе бакуловирусов для Е. соВ и клеток насекомых называкхт бакмилами. Система на основе бакыил позволяет создать еще одну плазмиду Е. со11, в которой между промотором и сайтом терминации гена полиэдрина встроен ген-мишень (плазмида-донор). В донорной плазмиде ген устойчивости к гентамнцнну н единица экспрессии гена-мишени фланкированы нуклеотнлными последовательностями, которые Рвс.
7.11. Получение рекомбннантных бакуловирусов. В геном АсМ)ЧРН, а именно в ген 603 н ген ОКР! 629, необхолимый лля рспликации бакулоаируса а клетках насекомых, встраивают по олному Взи361-сайту. чти гены фланкируют ген гюлиэлрина АсМ)ЧРЧ. Инкубируют рскомбинантный бакулоаирус с Вга361, в результате чего аышснлястся фрагмент, находящийся между Ваи361-сайтами, Трансфицируют клетки насекомого, несущие бакуловирус, который был обработан Вхи361, транспортным вектором с клонированным геном, фланкированиым промотором (я) и сайтом терминации транскрипции (г) гена полиэдрнна, а также с гюлнсразмсрным геном 603 и геном, необходимым лля рспликацни. В результате двойного крсссингоаера (пунктирные линии) образуется рекомбинантный бакуловирус с функционирующим геном, необходимым для репликапни.
Выхол рекомбинантных бакуловирусов в такой системс сссгааляст 99%. связывакггся с сайтом интеграции в бакмиде, а ген устойчивости к ампициллнну находится вне двух сайтов встраивания (рис. 7.12, Ь). Рекомбинация между соответствующими сайтами в Лонорной плазмиде и бакмнле может происходить только в присутствии специфичных белков (белков транс- позиции), которые в этой системе кодируются третьей плазмидой Е. сой (плазмндой-помощницей), несущей еще и ген устойчивости к тетрациклину (рис. 7.12, Е).
Бактериальные клетки, несущие бакмилу, трансформируют одновременно плазмцдой-по- 148 ГЛАВА 7 А Геном Аем1ЧРУ 1г о~ЛИ Кл,н Плазмила К сса Б Бакм яда Ал,р~ ДоиоРиаа плазм идя л Рскомбииантиая бакмила р Гея- г ап1. 1ас2' Кап' изв 3' -мишень У 1аси'а!гй Спу Рис. 7.12.
Получение рекомбинантной бакмиды. А. Плазмилу Е. со11 встраигмкл в геном АсМ1ЧРУ с помощью лвойного кроссинговера (пунктирные линии) межлу сегментами ДНК (5 и 3 ), фланкирующими ген полиэдрина, с образованием челночного вектора, способного к репликацин как в Е. со11, так и в клетках насекомых. Встраиваемая плазмнлная ДНК содержит ген устойчивости к канамицину (Кап', сайт интеграции (а11), клоиировапный без нарушения рамки считывания в последовательности 1асл, и сайт инициации репликации Е. сой (оп+). Б. Фрагмент донорной плазмиды, ограниченный двумя сайтами интеграции (аггй н аггГ) и несущий ген устойчивости к гентамицнну (бпг) и ген-мишень пол контролем промотора (р) и сайта терминации транскрипции (б гена полиэдрина, встраивают в сайт интеграции (ац) бакмиды с помощью белков транспозиции, кодируемых плазмидой-помощницей. Плазмида-помощница и донорная плазмнла несут гены устойчивости к тетрациклнну (Тес) и ампициллину (Атр') соответственно.
В. Рекомбинантная бакмида содержит дефектный ген 1асУ.'(*). Угловой стрелкой обозначен сайт инициации транскрипции клоннрованного гена после трансфекции клеток насекомого рекомбинантной бакмидой. мощницей и донорной плазмидой. В некоторых двойных трансформантах фрагмент ДНК, ограниченный двумя сайтами интеграции, встраивается в сайт интеграции бакмнды (рис. 7.12, Б и Б). Встраивание фрагмента донорной плазмиды с единицей экспрессии и геном устойчивости к гентамицину в сайт ицтеграцни бакмиды нарушает рамку считывания гена 1асУ.
В результате бактерии, несущие рекомбинантные (со всгройкой) бакмнды, образуют белые колонии в присутствии изопропил-р-г)-тиогалактопиранозида (ИПТГ) н 5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-Р-галак- Полп1ение рекомбииантиых белков с помощью эукаристических систем !49 топиранозида <Х-Оа)). Те из них, которые устойчивы к канамицину и чувствительны к ампициллину и тетрациклину, несут только рекомбинантную бакмиду, но не донорную плазмиду и плазмиду-помощнипу.
В наличии вставки клоцированного гена после всех этих манипуляций можно убелиться при помощи ПЦР. Далее рекомбинантной бакмидой можно трансфицировать клетки насекомою, в которых произойдет транскрипция клонировапного гена и синтез рекомбинантного белка. Для создания экспресспрующих векторов на основе бакуловирусов испольювались и другие подходы. Один из них предгюлапш проведение всех генноинженерных манипуляций с геномом АсМ)х РЧ в дрожжевых клетках с использованием челночного вектора для дрожжей и клеток насекомых с последухппим введением рекомбинантного бакуловируса в клетки насекомого. В другом для создания конструкции «клонировапный ген — геном АсМХРЧ» использовали систему рекомбинации ~ш Игго, основанную па вырезании — встраивании ДНК бактериофага Р(, после чего такой конструкцией напрямую трансфицировали клетки насекомого.
Выделение рекомбинанпгного белка из клеток насекомых с' помощью аффинного связывания Для выделения специфических гетерологичных белков из клеточных экстрактов и из смесей секретируемых белков можно использовать разные подходы. Один из них основывается на присоединении к клонированному»сну — без нарушения рамки считывания — сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой.
Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор межлу промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффицной метки. В одном случае перед клонированным геном был встроен — без нарушения рамки считывания — сегмент ДНК, кодирующий шесть остатков гистидина (Н1з„), спейсерцый участок, кодирующий семь аминокислот, и сайт расц~епления протеиназы из шести аминокислот; получившийся рекомбинантный белок вьшеляли хроматографией на колонке с никель-агарозой. Последовательность из шести остатков гистилина (гексагистпдин) связывалась с ионами пикши, и рекомбипантный белок задерживался в колонке. Его элюировали добавлением конкурирующего соединения (например, имидазола), который вытеснял гексагистидин рекомбинантного белка из комплекса с ионами никеля, или понижением рН буфера для элюции.
Аффинную метку отщепляли с помощью протеолитического фермента (протеиназы) и очищали рекомбинантный белок ог нее и от протеицазы хроматографическими методами. Если рекомбинантный белок це предполагается использовать в медицинских целях, можно и не отщеплять гексагистидиновую последовательность, поскольку обычно она не влияет ца структуру и функцию белка. Было разработано несколько аффинных меток.
Среди них —. глутатионтрансфераза, белок, связывающий мальтозу, и короткие аминокислотные последовательности — аптигецные детерминанты, которые связываются соответственно с глутатионом, мальтозой и специфическими антителами. Использовали и разные сайты расщепления, специфичные для тромбина, энтерокиназы и других протеиназ. Аффинцая метка и саит расщепления могут находиться как на )ч-, так и на С-конце рекомбинантного белка и использоваться в прокариотических системах экспрессии, а глюке в системах экспрессии ца основе клеток насекомых, млекопитающих или грибов.
Экспрессирующие векторы лля работы с клетками млекопитагощих Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, кспорые потенциально могут использоваться в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека. Уже сконструированные экспрессирующие векторы млекопитающих весьма многочисленны, но все они обладают сходными свойствами и похожи на другие эукариотические экспрессирующие векторы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
