Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Несмотря на все преимушества, УАС пока не использовались лля промыл плен ного синтеза гст ерологичн ых бел ков Прямая экспрессия я о. гегеля(ае Термин «прямая экспрсссияя применяется лля описания векторных систем, при использова- нии которых синтезированные белки нккумули- (ЗХ ГЛАВА 7 АВВ СЯЧ Ята! А с оп я Ваты! Ватн! Ваяя П В ха! Щолочиая фосфотяза А г ВЛАЗ ТВР! АЛЯ Сап' Т Во| раиваиие ДН К (>! ОО т. и. и.! Лигироааиие опа Атр' оВАЗ Т ТВР1 АВЯ СЕЛ' таких веществ и принимает участие цитоплазматический фермент Сц/Уп-супсроксид-дисмутаза (Сц/Уп-БОО»; он катализирует связывание супероксид-аннана и иона водорода с образованием пероксида водорода, который в свою очередь служит субстратом для каталазы или пероксидазы. Супероксид-инион образуется также при повторной псрфузии органа, кровоснабжение которого было прекращено перед хирургическим вмешательством.
Чтобы избежать повреждения клеток супероксид-анионом, исследователи предложили перед повторной перфузией вводить в ори!и Сз)/Хп-БО!). Сп/Хп-КОТ) может использоваться также для лечения таких воспалительных заболеваний, как остеоартрит, ревматоидный артрит, склеродсрмия и болезнь Бехтерева. При этом в руются в питоплазмс хозяйской клетки.
Несколькими группами исследователей были разработаны различныс экспрессирующие дрожжевые векторы, но все они имеют сходные основные черты. Мы рассмотрим процесс экспрессии чужеродного гена в Х сегер(з(ае на примере синтеза фермента суперокснл-лисмугазы человека. Супероксид-анион — это побочный продукт упзлизации кислорода аэробными организмами.
У человека он участвует в стимуляции иммунного ответа фагоцитов и направлении лейкоцитов к месту инфекции. Однако избыток данного соединения и его производных может вызывать повреждение клеток. В лзинимизации потенциального цитотокснческого воздействия Рис. 7.3. УАС-сир гема клонирования. тАС-плазмила (р тАС» содержит селективный маркерный геи Е соВ (Ашр'); саит инициации репликации, функционирующий в Е. сод (опе»,' сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки (ГВАЗ, СЕАг, 7ЗР1 и АЮЮ (СЕЛ' — последовательность, выполняющая Пептромерную функцию, АВЮ -- дрожжевая автономно реплипируюшаяся последовательность, эквивалентная дрожжевому сайту инициации репликации, (1ЕАЗ вЂ” один из генов биосинтеза урацила, ТЕР1 — один из генов биосиитеза триптофана». Т вЂ” это тело- мерные области дрожжевой хромосомы, Ята! — сайт, по которому осуществляется клонирование.
рУАС сначала обрабатывают Ята», ВатН! и щелочной фосфатазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК длиной (00 т. и. н. Конечная генетическая конструкция содержит клоиированную ДНК я может стабильно поддерживаться в дрож:кевых клетках (7га Тгр Получение рекомбцнантных белков с помощью эукарнотнчсских снегам 139 обоих случаях лучше использовать белок, аугентнчный Сц/Хп-КОИ человека, для того чтобы избежать любых нежелательных иммунных реакций, которые могут возникнуть прн введении фермента от других видов. Первоначально кДНК Сц/Хп-БО)3 человека была клонирована в системе экспрессии Е со/Е Но в этом случае от молекулы Сц/Хп-ВОН только отщсплялся инициаторный )ч-концевой мстионнн — так, как это происходит со всеми белками, синтезируемымн в Е.
со/(, а следующая аминокислота (алании) не ацстилировалась, как в клетках человека. Поэтому для получения аутентичного фермента кДНК Сц/Хп-БОГ) человека была встроена в дрожжевой эписомный вектор. Дрожжевые клетки не способны эффективно вырезать интроны, поэтому для кодирования специфичных генных продуктов необходимо использовать соответствующие кДНК или химически синтезированные последовательности. Дрожжевой вектор с кДН К Сц/г.п-БОг) человека (рис.
7.4) содержал: !) дрожжевой ген биосинтеза лейцина (ЕЕ(/2); 2) сегмент 2мкмплазмнды с сигналом инициации репликации ДНК дрожжей, что обеспечивало репликацию плазмиды в дрожжевых клетках; 3) селективный маркер — Е. со((-ген устойчивости к ампицнллину (Ашр') н сайт инициации репликации, активный в Е. соб, что позволяет осуществлять стандартные гснноннженсрныс манипуляции, необходнмыс для создания плазмиды, в клетках Е.
сей; 4) кДНК Сц/Хп-БОО человека, встроенную между промотором дрожжевого гена глицсральдсгидфосфатдсгидрогсназы ( САП)Р) и последовательностью, содержащей сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК того же гена (6АР/)2). Этим вектором трансформировали штамм дрожжей, не способный к синтезу лсйцнна (СВП2 ), и высевали их на среду без лейцина. В этих условиях могут расти только клетки с функционирующим ХЕ(/2-геном, находящимся в векторе. 6АРХ>-промотор не регулируется, транскрипция с него происходит непрерывно. Поэтому кДНК Сц/Хп-ЯОП человека транскрибнруется в течение всего периода роста (конститутнвно).
В этом эксперименте в дрожжевых клетках накапливались болыпне количества Сц/Уп-БОО, в котором, подобно нагивному 2мкм- плазмила, сс)мент а ГЕР2 кднк Сп/Хп-ЬОГЭ 6А Рор 2мканплазз сегмент Апзе' опт Рнс. 7.4. Экспрссснрующнй вектор Х ссгепйюе. Между промотором (6АРРР) и сигналом термннацнн-полналеннлнрованнл (6АР222) гена глнцеральлегнлфосфатдегндрогеназы Х сетабипе встроена кДНК Сц/Хп-ЯОП человека. Ген ЕЕ62, встроенный в середин> др<пкжевой 2мкм-плазаощы, кодирует один нз ферментов биоснцтеза лейцнна. Ген устойчивости к ампнцнллнну (Ашр) н сайт нннцнацнн реплнкацнн Е. соб (омв) персклоннрованы нз цлазмнды рВй322.
белку из клеток человека, аминогруппа Х-концевого остатка аланина была ацетнлнрована. Секреция гетервлогичных белков, синтезируемых Х еегеияае В дрожжевых клетках гликозилируются только секрстируемыс белки, поэтому для получения рскомбинантных белков, которые для перехода в активную форму должны подвергнуться Х- или О-гликозилиронацию, необходимо использовать системы секреции. Для этого перса кДНК, которая кодирует интересующий исследователя белок, нужно поместить так называемый про-про-а-фактор — лидерную (сигнальнукз) последовательность гена а, фактора спаривания дрожжей.
Синтезируемый рекомбннантный белок сможет в этом случае эффективно секретироваться дрожжами. Во время транспорта белка в нем образуются днсульфидные связи, происходят протсолнтическое расщепление и другие посттрансляцнонные модификации, так что в некоторых случаях в среду попадает уже активный белок. Лндерный пептид обеспечивает проникновение белка через цитоплазматнчсскую мембрану и секрецию, при этом сам он отщепляется дрожжевой эндопротеиназой, узнающей днпептид 1 уз-Ага. Поэ- !40 ! лА11А т тому копоны 1 уз и Агв должны располагаться непосредственно перел кДНК, так чтобы после отщеплсния сигнального пептипа синтезированный белок солержач на Х-конце нужный аминокисло гпый остаток. Используя эписомный зкспрсссируюший вектор с сигнальной последовательностью о-фактора, удалось получить правильным образом модифицированный, биологически активный белок гирулип; он синтезировался и секретировался штаммом Х св.еияае. Ген гирулина был выделен из клеток беспозвоночного -- пиявки Иглй~ л|ешс1аа!ьь Этот белок является мощным антикоагуля|гюм и не вызывает нежелательных иммунологических реакций у чсловска.
Его можно получать в активной форме в больших количествах, что упростило исследование его способности разрушать сгустки венозной крови и устранять лругис проявления тромбоза. К сожалению, клинические исследования !2 142 больных, у 413! из которых имелись серлечнососудистые заболевания, выявили лишь пезначитсльныс преимущества рскомбинантного гирулина перел гепарином.
Эти преимущества не могут компенсировать высокую стоимость рекомбинантного гирулина, так что его широкое использование в клинике представляется маловероятным. Чтобы повысить эффективность секреции рекомбинантных белков штаммами Х сегеияае, были г!ре~шрипяты дальнейшие исслелования. Так, попытались выясниз ь, способствует ли повышению выхода рекомбинаптного белка суперзкспрсссия такого природного фермента системы секреции, как лисульфидизомераза, которая обеспечивает правильную укладку белковой молекулы в процессе секреции. Для этою в хромосому Х сеге1чяае встроили ген дрожжевой лисульфидизомсразы, нахолящи йся поЛ конт ролем конститутивного промотора глицеральпсгилфосфатлстилрогеназы и сигнала терминапии транскрипции.
Уровень синтеза Лисульфилизомеразы модифицированным штаммом был в !б раз выше по сравнению со штаммом дикою типа. Далее в штамм — суперпролуцент лисульфидизомсразы ввели внехромосомный зкспрессируюп!ий вектор, несущий ген фактора роста тромбоцитов В человека. Количество секретирусмою за им |птаммом тромбоцитарпого фактора роста В человека превысило в 10 раз количество Фактора, сскрстируемого штаммом с нормальным уровнем синтеза лисульфилизомеразы. Суперпролукция дисульфилизомеразы повышаез секрецию белков только с лисульфилными связями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
