Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Изменение лругих белков дрожжевой системы секреции может повысить количество сскрстируемых рскомбинантных белков с другими требованиями к укладке белковой молекулы. Другие дрожжевые системы экспрессии С помощью систем экспрессии Х сеееияае удалось получить много разных рекомбинантных белков. К сожалению, в большинстве случаев уровень их экспрессии был ловольно низким. Кроме того, обнаружились и лругис проблемы.
я При увеличении масштабов системы часто происходит потеря плазмил, лаже если использукпся индуцируемые промоторы. ° Гетерологичный белок зачастую оказывается гипсргликозилированным и содержит более !00 остатков маннозы в каждой боковой олигосахарияной цепи, в то время как в нативных белках их солсржится только от 8 ло!3 на цепь. Наличие лишних маннозных остатков может изменять биологическук> активность продукта или его иммуногснность. Во многих экспериментах белки, которые должны были секретироваться, на самом леле концентрировались в псриплазматическом пространстве, что еше более осложняло их очистку. Все это заставило ученых исслсловать возможность получения гстсрологичных белков с помощью других видов дрожжей и с использованием эукариотичсских систем.
В часпюсти, изучались соответствующие векторы — системы экспрессии, содержащие вилоспецифичные регуляторныс послсповательности транскрипции и трансляции, возможность трансформация этих вилов и получения высокого выхола белков и возможность крупномаспггабного культивирования организма-хозяина. В качестве алшсрнативы Х сегеуйпае можно использовать КЬугегптусез!асГД, дрожжи, которые применяют для промьппленного произвопства лактозы 1>оду>ение рекомбииантных белков с помощью эукариотических систем 14! ((>-галакто>и!>азь>); зс!>!гт>тасс!>ага>аусат ратЬе„ лрожжи, размножающиеся делением, а не почкованием; уаггот»а Про!у!!еа, которь>с используют ялкапы в качестве субстрата; Р>с/аа раз!о>ув и НаьхетАа ро!утагрйа, которые могут использовать метанол как единственный источник углерода и энергии. Синтез поверхностного антигела вируса гепшпита В Метилотрофныс дрожжи Р.
Рааалз можно без труда и Гюльших затра> выршцивтпь в промьпплснных биорсакторах. Их использование в качестве организма-хозяина позволило бы увеличить выход активных продуктов - тетерологичных белков. Такой вывод можно сделать, рассмотрев в качестве примера получение поверхностного антигепа вируса >сна>и>а В (НВхАя) с помощью специально разработанной системы с использованием интсгрируютцсго вектора. Сначала ген НВ>ЛХ встроили между промотором гспа алко>ольоксидазы 1 (ЛОХ1р) и сип>а.юм терминации-полиадснилирования (АОХН) того же гена (рпс 7.5). Регуляция активности гена АОХ! Р.
рамоНе осуществляется с помо>цьк> метанола. В 3>-АОХ1 ВБ4 Х!> ЛОХ! р !!В>Лт Рис. 7.5. Интетрируютдий экспрессирующий вектор для Р. раэтот. Между про>>отаром (ЛОХ1р) и сигналом терминации-иолиаленилирования (ЛОХ/1) гена элкогольоксидазы 1 Р. раз!ага встроен геи НВеЛХ. !!!54 — ген, кодирующий один из ферментов биосинтеза гястндина, гистидиноллегилрогеназу.
Кроме тою, вектор содержит саят инициации реплякации Р. ра>1онт (опт"), ген устойчивости к ампициллииу (Аюрт) и саят инициации репликации, активный в Е. соя (опь). 3'-ЛОХ/ — это фрагмент 3'-концевой послед<>вятельиости гена алкотольоксидазы 1 Р. ратаопк Стрелками указан сегмент„который интегрируется в геном Р. раз!о>ук сто присутствии на долю алкогольоксидазы может приходиться ло 30% всех белков клетки, а в отсутствие метанола алкогольоксилаза нс ситтзсэируетс51 вообтце.
Вектор (рис. 7.5), спсциально сконсзруирт>- ванный для этих исслсловании, содержал следу>ощие элементы: 1) блок АОХ/р-НВ>АХ-ЛОХ!1; 2) сайт инициации реплика>>ии, функционирующий в Р. Рдтт>>г!»; 3) фрагмент ДН К, содержащий сайт инициации рс>иикации плазмилы рВ(ь322 и селективный маркер Е. со!!; 4) фрагмен> 3'- АОХ1, способствующий интеграции клонированной ДНК в опрс>>слеп>тьп> сайт хромосомы; 5) активный ген п>стилиноллегидрогеназы (Н/54), колируюший фермент, который участвует в синтезе аминокислоты гистилина. Наличие в этой коне>.рукции последовательностей рВК322 позволяет использовать лля работы с ней Г>'.
ет>!!, что облегчает клонирование и при необходимости позволяет получать большие колии честна векторной Д Н К. Чтобы предотвратить утрату плазмилы. была предусмотрена интеграция участка ЛОХ1рНВХАВ-АОХ1! в геном Р. РахгоПть Дла этого штамм Р, раттт>г!т Н154 с лсфсктныл> геном гистидинолдегидрогеназы трансформировали фрагментом вектора„содержащим элементы АОХ/р-НВ>АХ-АОХ!!, 11/Х>4 и 3 -АОХ! (рис.
7.5). В результате двойного кроссинговера между АГ)Х/р и 3'-ЛОХ1 введенной 115(К, с одной стороны, и комплементарными последовательностями хромосомной ДНК, с другой, произошла интеграция последовательностей ЛОХ!р-/!В>АеЛОХ1! и Н!54 в геном, сопровождающаяся утратой хромосомною гена АОХ1 (рис. 7.б). Клетки, в геном которых включился ген НЮ4, растут на среде без гистидина; этот признак может испольж>ваться лля их отбора. Вторым критерием отбора служит замедление роста клеток в присутствии метанола, поскольку после потери гена АОХ! после двойного кроссинговсра активным остается только один, менее эффективный ген А ОХ2 Клон с инте> рировавшим фрагментом АОХ/р-НВ>Ая-АГ)Х/! при росте в присутствии метанола, который активирует АОХ1-промотор, синтезировал в больших количествах аутентичный белок НВзАя, накапливающийся в цитотшазме.
Белковый продукт образовывал такой (42 ГЛАВА 7 Н(З4 Вскторяая ДНК Геиомиая ДН иомияя ДНК Геи АОХ1 Геиомиая ДНК У-А ОХ'! АОХгр НрмАХ А ОХ!> Н!Х4 Рис. 7.6. Интеграция части экспрессируюшего вектора в ген алкогольоксиаазы ! Р. Раз>о>тк В результате лвойното кроссииговера между геном АОХ! и участками АОХ!р и 3 -АОХ! (верхняя часть рисунка) пропсхолит интеграция вектора в гсномную Д!! К и утрата большей части гена алкогольоксилазы ! (АОХ1) хозяйской хромогя>мой (нижияя часть рисунка). Продукт гена Н!Х4 дает возможность клеткам расти иа среле без гистидииа.
В присутствии метанола АОХ1р активирует транскрипцию гена НВ>Ал, а А ОХ!г обеспечивает термииацию транскрипции и иолиаленилщм>ванне. же мультисубьединичный комплекс, как и соответствукиднй белок в клетках человека, инфицированных вирусом гепатита В, и связывался с антителами к этому вирусу. При выращивании ланного клона в 240-литровом ферментере периодического лействия количества сицтезируемого белка хватило бы примерно па !О> вакцинаций. При этом генетическая конструкция оставалась неизменной в течение 200 часов культивирования в присутствии метанола.
Сггнтез бычьего Аизоии>иа С2 Способность Р, рал!о>тл секретировать гетерологичный белок исследовали в системе с использованием кДНК бычьего лизоцима С2, кодирующей полноразмерный белок и его собственный лидсрный псптид. Бычий лизоцим — зто желудочный фермент, разрушающий клеточные стенки бактерий; он устойчив к протсазам и сохраняет активность в узком лиапазоне рН, что позволяет использовать сто в качестве добавки к кормам жвачных живо!ныл лля улучшения пищеварения. Вектор, созданный для это~о исследования, был идентичен вектору АОХ!р-НВлАе-АОХ!г, описанному вьппе, за искчюченисм того„что вместо кодирунлцей последовательности НВаАХ в пего была встроена кДНК лизоцима.
Вся плазмила была интегрирована в дсфектну>о копию гена Н1Н4 в хромосоме Р. раз!опл. В результате интеграции ген бычьего лизоцима оказывался фланкирован одним активным (Н!54) и одним дефектным (Н!Н4 ) генами гистидинолдегидрогеназы (рис. 7.7). Предшественник бычьего лизоцима процсссировался в Р.
раезопз и секретировался в среду, при этом удельная активность сскрстируемого белка была такой же, как у нативного фермента. При ферментации !О л культуры в течение 200 ч в непрерывном режиме при высокой плотности клеток синтезировалось примерно 20 г лизоцима. Аутентичные гетерологичные белки были получены и с помощью других дрожжевых систем. Например, кДНК а- и (3-цепей гемоглобина А человека были встроены между промотором (МОЛр) и сигналом терминации транскрипции (МОХ!) гена метанолоксидазы Надуева(а ро1утгмр!>а и помещены друг за другом в экспрсссиругощий вектор.
Через 40 генераций был взят изолят со случайно интегриро- Получение рекомбинаптных белков с помощью зукариотических систем 143 ая ЛНК яДНК Встроенная ДНК Геномная ДН К 777а4 Функциональный ген Н754 Дефектный ген Н7З4 Рис. 7.7. Интеграл ~ил экспрессир> ющего плазмидного вектора в дефектный хромосомный ген НХЯ4" 7з. разгогц. В результате кроссинговера между плазмилным геном Н7Ь4 и геном Н7о4 клетки-хозяина происходит интеграция в геном всей плазмиды, которая оказывается фланкнрованнои функциональным н дефектным генами Н7о4. р, 1.
и 7 — промотор АОХ7„кДНК бычьего лизоцима С2 и сигнал терминании транскрипции-полиаденилирования сгютветственно. Черная полоска — дефектный участок в 777о4 -ганс. Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых вавшим участком исходного вектора и показано, что в нем присутствует функциональный геьгог77обин А с правильной тетрамерной структурой: две и- и лве р-цепи (атр ). Кроме того, с использованием экспрессирующсго вектора для Х роглбе, несущего селективный маркерный ген и клонированный ген человека, оба пол контролем промоторов млекопитающих, были получены большие количества рекомбинантных белков, кодирусмых разными генами человека, Дрожжевые системы экспрессии стали играть важнук> роль в получении гетерологичных белков для научных, промышленных и медицинских целей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
