Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Чтобы решить эти проблемы, для получения рекомбинантных белков. предназначенных для использования в медицине, бьши разработаны эукариотические системы экспрессии. Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимическим, Физическим и Функциональным свойствам. Неспособность прокариот синтезировать аутентгшные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических постгрансляционныхмодификаций. Белки в клетках эукариот претерпевают следующие постгрансляционные изменения. ° Образование дисульфидных связей.
Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием Функционально активного белка. ° Гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают ста- бильность, а в некоторых случаях — особые свойства. Наиболее распространенная реакция гликолизирования — зто присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирование), либо к аспарагину (гч-гликолизированис).
° Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование и пальмитоилирование. Из всех этих модификаций прокариотические хозяйские клетки наименее всего способны осуществлять правильное глнкозилирование и модификацию специфических аминокислот в гетерологичном белке. Однако ни одна эукариотическая система не может осуществить одновременно все посттрансляционные изменения в каждом потенциальном гетерологичном белке. Таким образом, для получения белка с полным набором специфических модификаций необходимо провести тестирование различных эукариотических систем экспрессии и найти такую, которая воспроизводила бы биологически аутентичный продукт. Эукариотические экспрсссируюшие векторы имеют такую же структуру, что и их прокариотические аналоги (рис.
7Д), и должны содержать: ° эукариотический селективный маркер ° зукариотический промотор ° соответствующие эукариотичсские сайты тсрминации транскрипции и трансляции ° сигнал полиаденилирования мРНК. 136 ГЛАВА 7 опж А>в сы ои" ск Рис. 7.1. Обобщенная структура эукариотического экспрессирующего вектора. Гио основные элементы; эукариигический транскриптои с промотором (я), сайтом клонирования (СК) и сигналами термииапия и полиалеиилирояания (1); эукариотический селективный маркер (СМ); сайт инициации репликапии, Функционирующий в клетках эукариот (оп™); саят инициации репликации, Функционирующий в Е. ооа (ола); селективный л>аркер Е.
сод (Атр'). Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционируюп>ий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК. то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот. большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции н два типа селективнь>х маркерных генов, одни из которых функционируют в Ея«Ье«>с)на сг>11', а другие — в эукариотических хозяйских клетках.
Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей„насекомых и клеток млекопитающих. Введение ДНК в бактериальныс и дрожжевые клетки называется трансфорл>г>цией. В микробиологии этот термин используется для описания наследственных изменений в результате внедрения (приобретения) зкзогснной (чужеродной) ДНК. А применительно к животным клеткам трансформация обозначает изменение характера их роста в культуре, обусловленное превра>пением нормальных клеток в раковые.
Чтобы избежать путаницы в терминологии, для обозначения наследственных изменений и животных клетках после введения в них экзогенной ДНК был выбран термин транс4екция. Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически иля энзиматическн (протопласты) (1). В других случаях клегки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергак>т электропорации (3).
Трансфскцию культур животных клеток осуществляют инкубацисй клеток с ДНК, осажденной ФосФатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (!), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирук>шей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. 4, электропорация заключается в воздействии на клетки коротких мощных импульсов электрического тока, вследствие чего в наружной мембране или клеточной стенке образуются временныс поры, через которые в клетку может проникнуть ДНК.
В некоторых эукариотичсских системах лля доставки ДНК в реципиентныс клетки используют вирусы. Системы экспрессии Засела«а«пусе» се«еляае Для экспрессии клонированных эукариотических генов интенсивно используют обычные дрожжи Яи«с)>и>т»лусез св«етз>ае. Тому сеть несколько причин. Во-первых, это одноклеточный организм, генетика и физиология которого детально изучены и который можно вырап1ивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных биореакторах.
Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а лля систем зндогенных дрожжевых экснрессирующих векторов могут использоваться природные, так называемые 2 мкм-плазмиды. В-третьих, в клетках Х сс«ех>Э>ие осуществляется большое число посттрю1сляционных лгодиг(>иканий. В-четвертых, лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков сскрстируются в среду; таким образом, если гетерологнчный белок сскретирустся Получение рскомбннаптных белков с помощью эукврнотпчсскнх систем 137 клеткой, то сто очистка не составит большого труда. В-пг[тых, поскольку дрожжи уже многие голы используют в хлсбопечении и пивоварении, Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, меяикамснтов и косметических средств (США) включил Х сегепя[ае в список «организмов, призывных беюпасными> (ОКАЗ, Вепегайу гесойп!гес! аз загс).
Таким образом, использование этих организмов лля получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, нсобхолимых при работе с неразрешенными к примененикз микроорганизмами. Нскоторыс белки„синтезированные в з'. сегегбт!ае, уже применяются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики (рис. 7.2). ппстный агптпен вируса глпвтюя В малярийного плазмодия оболочки НШ-! ИКА пруст г«плтнгв С ы Н[У-! ЕННЫЕ ВЕЩЕСТВА роста зпндеры~св и ппполобпын Фактор роста Ннтврпый Фактор роста УЛН55 Роста Фнбрпблясчпв «стныулнруюпшй фактор гр«луп«я п сфагпя нтрнпснп Хи[я сясз«мы свертывания кровя Ряс.
7.2. Рекомбннантпые белки, сннтезнруемые в системах экспрессии у. гегеиз[ае. Н[Ч-! — Вирус иммунодефицита человека ! типа. Векторы для Ж свгер[я[ае Существует три типа экспрессируюших векторов лля Х сегеилаж 1) эписомныс, или нлазмилныс векторы; 2) интегрирующие векторы; 3) искусственные лрожжсвые хромосомы (УАС). Плазмилные векторы уже широко использовались лля получения как секретируемых, так и несекрстирусмых гетерологичпых белков. Однако системы экспрессии, основанные на использовании плазмил, зачасту[о оказываются нестабильными при выра- щнвании клеток в больших обьсмах (> И) л). Стратегия с использованием векторов второго типа пока нс получила широкого распространения, несмотря на то что в результате интеграции экспрсссирукзще[о векгора [ши транскриптона в хромосомную ДНК получается стабильный рскомбинантный организм.
Причиной этого служит то, что число копий клоннрованного гена ограничивается одной на хромосому, иными словами, конечный выход белка невысок. Можно было бы использовать танлсл[ныс псгслсловатсльности генов, но они часто оказываются нестабильными. Поэтому исследователи остановились на плазмилных Векторах с одним юкзпироваппым геном, но попытались изменить условия роста, с тем чтобы повысить стабильность плазмил. Искусственные дрожжевые хромосомы (УАС) предназначены л и клонирования болыпих фрагментов ДНК (100 т.
и. н.), которые затем гюллержиВаются В л!Южжевой клсткс как отлсльныс х[х)- мосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ес помоц[ыо проводили физиг[ескос кар гированис геномной ДНК человека и анализ большихчранскриптонов, создавали гсномные библиотеки, солержашие ДНК индивидуальных х!Юмосом человека. УАС-вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит послелова[ельностьч функпионируюгцую как сайт инициации репликации ДНК (аипзномно рсплицирующуюся послеловательность)„сегмент [[сн[Тюмерной области лрожжсвой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и лсйствующие как теломсры, обсспечивакзшие стабильность хромосомы (рис.
7.3). При встраивании чужеродной ДНК в УАС может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате пролукт этого гена цс образуется, н при выращивании клеток на специальной! срсле можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые УАС- векторы несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
