Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 34

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 34)

Вероятность трансляционных оггзнбок для Е сод составляет 2 . 10"4 — 2 10 т на 1 клетку за генерацию. Однако в условиях нехватки определенных аминоацил-тРНК, что часто случается прн суперпродукции чужеродных белков, всроятносп включения в белковую молекулу неправильной аминокислоты вместо недостающей сильно увеличивается. Кроме того, точность трансляции еше болыпе снижаегся из-за пелостатка ОТР, который является необходимым компонентом корректирующего аппарата.

В одгюй нз работ было показано, что в условиях гиперпродукции фактора роста эпидермиса мыши в клетках Е. со)г' чацгота ошибочных включений аминокислот в рекомбинантный белок увсличи- вается в !О раз. Это не позволяет использовать синтезируемый белок в качестве лекарственного средства, поскольку: !) удельная активность и стабильность белка могут быть гораздо ниже ожидаемых; 2) наличие в молекуле «неправильных» амип<укислот может вызвать нежелательную иммунологическую реакцию при введения такого белка в организм человека. К счастью, правилыю спланнровав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболическойй перегрузки, оьп имизпровать выход рекомбинантного белка и повысить стабильносп трансформировагшых хозяйских клеток.

Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмилные векторы. А еше лунце вообще отказаться ог векторов и встроить чужеродную ДН К в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае пе нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмилы. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов. копируемых маркерными генами устойчивости к антибиогикайг.

Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Иьпеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях фермснтацию провопят в две стадии. Нл первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскригщию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции,— включен.

Оптимизапия экспрессии генов, клонироианных в прокаришических системах 129 Глюкоза — —.и Биомасса Аиетолкктат Аисты>-СоА . Ацотоии Аио> золло>ил Этаиои Рис. 6.17. Схематическое предсгивлепие метаболизл>а глюкозы в клетках Е.

са!>', трансформированнык плазмидой, несущей гены анетолактатсиитазы. Лактат Если частота использования кодонов у чужеродного гспа отличается от таковой у организма- хозяина, то проблему иехватки специфических ал>иноацил-тРН К можно решить, синтезировав часть гена-мишени или даже весь геи с более близким к хозяйскому организму набором колонов. Так, в одном из исследований было показано, что количество стрептавидина, образующегося при экспрессии синтетического гена с ОС-содержаиием 54%, было в !О раз больше, чем при экспрессии «приролного» гена с С>С- содержанием 69%. Однако этот подход довольно сложен и может примениться лишь и редких случаях. Как это ни парадоксально, но один из способов увеличения количества чужеродного белка, сиптезируемого рекомбинантным микроорганизмом, сосгои.г в подлержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клегочпого белка), по зато в максимальном увеличении плотности культуры.

Микробиологическая система с 5%а-цым уровнем экспрессии чужеродпого белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может досгигать 40 г/л (масса сухо> о вещества)„оказывается более эффективной, чем система с 15%-иым уров»ем экспрессии и плотцостън> 10 г/л. Достичь одновременно и высокоп> уровня синтеза чужеродного белка, и высокой плотности культуры часто не удается из-за накопления вредных побочных продуктов (в первую очередь ацетата), подавлякнцих рост клеток и синтез белка. Чтобы умецыпить накоплепие ацетата в богатой среде, пе нарушая роста клеток, можно снизить скорость поглощения глюкозы, добавив в среду ее аналог, метил-а-глюкозид.

Альтернативнь>й подход состоит в использовании клеток Е. са!>, несущих мутацию в гепе р>иО, который кодирует фермент П глюкозофосфотрансферазиой системы. Максимальная плотность кул>дуры Е. сай дикого типа составила примерпо 10 г/л, а культуры Е. са/> с мутацией в гене рй(> — 15 г/л. Кроме того, уровень синтеза 1)-лактал>азы в мутантных клетках был иа 25% выше (на ! г массы сухого вещества), чем в клетках дикого типа, так что суммарное различие достигает примерно двукрапюй величины.

Достичь аналогичного резул>пата можно гораздо проще и быстрее, если использовать мстоды генной инженерии, а це мутагенез и отбор. Один из подходов состоял во введении в Е сай Фоофооноииируик> — е — и Г укииикт 130 ГЛАВА 6 генов, кодирующих ацетолактатсинтазу. Этот фермент катализирует образование ацетолактата из пирувата, что приводит к уменьшению количества образующегося ацетата (рис. 6.17). Гены ацетолактатсинтазы вводят в клетки в составе одной плазмиды, а гены-мишени — в составе др)той, из другой группы несовместимости.

Трансформированные клетки синтезируют гораздо меньше ацетата, чем нетрансформированные; вместо него образуется ацетоин, соединение примерно в 50 раз менее токсичное, чем ацетат. злключкник Чтобы получить какой-то белковый продукт, необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки — терминирующпй кодон.

Клонированный ген часто бывает лишен таких сипшльных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозязше нужно обеспечить и то, и другое. Кроме то~о, поскольку для решения большинсгва биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции (сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постояно ~ах транскрипция клопированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических цизкомолекулярных соединений, либо изменением температуры. Эффективносп синтеза белка зависит от наличия в его мРНК специфических нуклеотидных последовательностей.

Чтобы предотвратить разрушение белково! о продукта или обеспечить его секрецию, клопированныс гены, которые кодируют этот белок, подвергают направленным изменениям. Это может быть присоединение сайта связывания рибосомы перед сайтом инициации транскрипции (который в свою очередь тоже бывает нужно присоединить) или до- бавление к концу клонированного гена терминпруюн~его колона, который обеспечивал бы остановку трансляции. Если нужно, чтобы белок секретировался, то перед клонирова~ ~ным геном необходимо встроить сигнальную последовательность, рамка считывания которой согласуется с таковой гена-мишени.

Еще одна проблема — невысокая стабильность белков, кодируемых клонировацными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться протеиназами хозяйской клетки. Чтобы избежап этого, можно изменить клонированпый ген таким образом, чтобы на Х-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, «лишние» аминокислогы иногда помошют в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии па колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему люжно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде.

Большинство микроорганизмов, с помощью которых получают белковые продукты, растут только в присутствии кислорода. Последний плохо растворяется в воде, и при интенсивном росте его запасы быстро истощаются. Чтобы обойти эту трудность, использовали два пути: 1) применяли штаммы, неспособные синтезировать пекоторью протеолитические ферменты; 2) включали в геном хозяйских клеток гены, кодирующие гемоглобин ИггеохсИа зр., который связывает кислород окружающей средгя и повышает его концентрацию в клетке. С увеличением числа копий клонированноп> гена увеличивается количество синтезируемого продукта. Однако при переходе к крупномасштабному производству конструкция «плазмида/клонированная ДНК» очень часто утрачивается. Чтобы избежать этого, разработали способы интеграции клопированного гена в хромосому организма-хозяина.

В этом случае ген остается в клетке как часть хозяйской ДНК. Введение в геном организма-хозяина и экспрессия чужерод~ юй ДН К часто приводят к нарушению его метаболизма и нормального функционирования — так называемой метаболической Оптимизация экспрессии генов, клоннроаанных в нрокариотических системах 131 перегрузке.

Разработан целый ряд способов, позволягощих минимизировать этот эффект и одновременно оптимизировать выход белка-мишени и сибил ы юсть трансформированных клеток. Системы экспрессии весьма разнообразны, и исследователям приходится каждый раз полбирать условия, наиболее подходящие для получения того или иного белка в том или ином организме-хозяипе. И все же, несмотря на различия в деталях, для создания самых разных систем экспрессии используются одни и те же основныс приемы. ЛИТЕРАТУРА Аспапп Е., Л. Вгояиь. 1985. "АТО чессогь'" Гог геди!а1ес! ЫдЬ-!ече1 ехргеььюп оГ с1опеь депез !п Еьс(гепсЬ!а со!!. бела 40: 183 — 190. Апв!1с!ои А.

Характеристики

Список файлов книги