Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Между генами тиоредекснна и белка-мишени нахолизся нуклеотидная последовательность, которая кодирует пензия, расщепляемый энтерокиназой. Подковообразными кривыми изображено связыаание репрессоров с соответствующими операторами. Оохимизяпия экспрессии генов, клонированных в прокариотвчсских системах 117 гвс. б.!О.
Химерные белки, состоящие из поверх1юстиого бактериального белка и чужеролного белкамишсни, присоединенного к его )Ч- или С-концу (А) либо включенного в экспонируемые участки »1олекулы (Б). В обоих случаях чужеродные легцилы или белок оказываются на поверхности бактериальной клем ки. Системы слияния с локализацией белков- мишеней на поверхности бактериальных клеток можно использовать также для супериролукцин некоторых белков и пептидов.
Так, в одной из работ в участок, коднруюи)ий основной белок наружной мембраны Рхеве)стопах пегих)поза (Оргг), был встроен ген антигснного детерминанта возбудителя малярии Р1ахто«Бит Ра)с1- рагипь Бактериальные клетки, синтезирующие соответствующий химерный белок, давали положительную реакцию с моноклоняльными антителами к Р.Ра1сурап~т. Следовательно, иоверхностиые химерные белки можно использовать в качестве вакцин (гл. 11). Однонаправленное тандемное расположение генов Обычно уровены енной экспрессии пропорционален числу копий транскрибируемого гена в хозяйских клетках. Отсюда следует, что с увели- чснием числа копий илязмиды должно увеличиваться н количество продукта встроенного в эту илазмнду гена.
Однако помимо клонируемого геня илазмида содержит и дру~ не траискрибирусмыс иоследоватсльности, например гены устойчивости к антибиотикам, и ио мере увеличения ес коиийностн энергетические ресурсы клетки будуг во все большей сзсиенн направляться на образование белков, кодирусмых илазмилой, и метаболичсская активность хозяйской клетки упадет.
Выходом из этой ситуации могло бы стать встраивание в малокоиийную илазмилу нескольких копий интересующего исследователя гена. Олняко ири этом возникает одна техническая проблема — расположение ~ снов в такой ориентации, чтобы все они могли правильно транскрибироваться и транслироваться. Простое сшиванис «конец-в-конец» приводит к случайной ориентации генов, так что одни нз них эксирессируются, а другие, нахоляшиеся в противоположной ориентации, — нет (рнс. 6.11). Чтобы решить эту проблему можно исиользовать рестрицнрующий фермент Ава1, который узнает иослсдоватсльность СТСООО и разрезает ДНК с 5'-конца от остатка Т. Процедура состоит в слелуюшем.
Плазмиду, содержащую эту иоследовательностгч разрезают с помощью Ава1 и, используя ДНК-иолимеразу 1, лостраивают липкие концы. Зател1 к обоим ее туиым кохи)ам иристраивают Есой)-линкор (СААТТС), вновь замыкая кольцо. Получившаяся шгазмидя содержит сегмент Д)!К с двумя Ааа1-сайтамн, фланкирующими Есой)-сайт и перекрывающимися с ним (рис.
6.12, А н 6), т. е. последовательность СТС(1 О«7ААТ ТСТСх)ОЯ (здесь иолчеркнутые основания — сайгы узнавания лля Ага!). Нужный ген вместе с трансляиионными старт- и стоп-сигналами встраивают в Есой)-сайт и затем вырезают из илазмилы с помощью Ага) (рис. 6.!2, й). Такие фрагменты имеют нендеитичные лиикие концы, и поэтому цри иоследу|ощем сшивании соединяются в олной ориентации. Подобный набор однона1 правленных тандемных кошлй гена может быть встроен в экспрессирующий вектор.
При этом тандсмная последовательность может находиться в двух ориентациях относительно иромоторя, так что ес эксирсссия будет происходить только в 50егй случаев. 118 ГЛАВА 6 А. Вырезяпш ге гены АЬс! АЬс! 'ду~ Ь; тандемные повторы, образующиеся после сшивания АЬс! АЬс! Аьс! АЬс1 АЬс! АЬс1 АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬг! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! АЬс! Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А.
Кланираванные гены выреза!от из кланирующсга вектора с помощью рестрицируюшей энлануклсазы АЬс! н пуделя!от ат векторной ДНК. Ь. Саада!от условия, при которых происходит сшипапие вырезанных генов. Поскольку нуклеатяггные паслелавательнасг и обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации, В результате образуются тагщемные повторы из случайно ориентированных последовательностей. Транслиционные экснрессиру!ощие векторы Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адапторов— коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном.
При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется рестрицирующая эндонуклеаза Ара!; кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали Ара1- и ЕсоИ-сан!ты.
Уже показано экспериментально, что уровень экспрессии генов интерферона действительно увеличивается пропорционально числу тандемных копий гена, по крайней мере до четырех копий на плазмиду. Олнако тандемные повторы иногда оказываются нестабильными и со временем некоторые из пих или даже все утрачиваются плазмидой. Наличие сильного регулируемого промотора— это очень важное, но недостаточное условие макснлеизации количества продукта клонированного гена.
Большую роль играют также эффективность трансляции и стабильность самого продукта. В прокаргиотических клетках разные мРНК не всегда транслируются с одинаковой эффективностью, Различие может составить несколько сотен раз, и в результате в клетке будут присутствовать сотни или даже тысячи копий одних белковых молекул и лишь несколько копий других. Различия в трансляции связаны — по крайней мере частично — со свойствами имеющегося в транскрибированной РН К сигнала инициации трансляции, называемого сайтом связывания рибосомы. Сайт связывания рибосомы — эта Огпнмизация зкспрессии генов, клонированных в прокариотических сисщл»ах 119 — СТСССС— — САСССС— ТСССС— С— — С вЂ” САССС Яма! ДНК-полимераза ! Есой1-ли»»кер ДН К-лигаза Т4 Яга! Есой! Я»»а1 с-- — « с т сссч» А А т т с !т с с ссв САССС!С Т ТААС!АСССС— тСССС Г ~~ ~С тСССС Г »Млл "~ )С тСССС Г ) С.
С ) .. ':» ' ) САССС С ) з'"' .|С»АССС С 1 ".„. ' ) САССС Д НК-лигаза Т4 тсссс Г=: )стсссс)- — -- —,-)стсссс Г~ ~с. САСССС |,~ ~САСССС |,л~ |САССС А А А — 0 | ДН К-полимераза ! — С Т ССС Т СССС— — САССС АСССС— | Есой)-линкер ДНК-лига»а Т4 Рис. 6.12. Клонирование нескольких копий гена в одной плазмнле.
Л. Созда!»ие вектора. Плазмилу разрезаю!по Л»»а1-сайту и образовавшиеся липкие концы достраивают с помощью ДНК-полимеразы ! К сор« К тупым концам присоедннязот Есг»К1-лиг»кер, замыкающий кольцо. Б. Встраивание ссоК1-ли!»кора в Лга1-сайт в плазмиде. В. Образование однонаправленного тандемного повтора. Рис. 6 13. Вну»рицепочечнос спаривание в молекуле мРНК, препятствующее эффективной трансляции. ССССΠ— сайт связывания рибосомы, АТ)С (красные буквы) — инициаторный кодон, САС-САП-СА1)-1)1)АООΠ— несколько первых кодонов. Обратите внимание, что кроме обычных для мРНК пар А.П и С С иногда образуются пары ОД!.
А С С С вЂ” С О вЂ” * Л вЂ” и 0 — С А — 0 Л вЂ” 0 С А С вЂ” О С вЂ” 0 С вЂ” и 5' САЛССС «СЛЛСАС 3' 120 ГЛАВА 6 3 ° гас-Промотор: функциональный гибрид, полученный из г!р- и 1ас-промоторов Н. А. ОсВоег, 1. 3. Солж!ос);, М. 3>аазег Раас.
Лак Асад. кс>. ГУА 80> 21 — 25, 1983 лее тою силу промотора увеличивали только ге му>ации, в результате которых нуклео>идные последовательности указанных облас>.ей приближались к консенсусным: 5'-ТАТАА1'-3' для — 1О и 5 з'П ОАСА-3 для — 35 соответственно. Эти последовательности были получены в результате сравнения нуклсогилных послеловатсльностей всех извссю>ых промогоров и идентификации наиболее часто астречак>шихся нуклеотидоа.
Де Боеру было известно, что у промоюра !асбУ5, более сильною варианта |ас-промшора, — 10-облас>ь ил>ест консенсусную нуклеотилную послеловательпость, а -35-область — нет, а у яр-г>ромотора, в норме контролирующего транскриппик»снов, которые отвечают за биосинтез триптофана, ситуация ння рибосомы и несколько первых кодопов клонированного гена, не должен иметь такую нуклеотид>гую последовательность, »ри которой после транскрипции может произойти внутрицепочечное спаривание (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
