Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Проводят несколько раундов амплификации при участии указанных ораймеров, добавляют вторые праймеры (ОВР2 и Р) и получают хДНК, отвечающую 5'-концу ллР)!К. лля синтеза первой цепи кДН К служит о))яо(()Т) с присоединенным к нему вторым праймсром (Р) (рис. 5.22). 0))яо(е)Т) спаривается с ро!у(А)- хвостом мРНК, и обратная транскриптаза синтезирует цепь, комплемснзарную мРНК. Вторая цепь кДНК синтезируется на первой при участии ОЯР, комплсментарноьо коднруюшсй области данной мРНК, с помощью полилтсразы ПВ ГЛАВА 5 В | Г! Ц Р-амг1лифиха пил В' 3 В Добавление олигонуклеопглов С и ГЗ ДсьагурацГгягатжиг А' В ПЦР-алгллификация С А 5' 3' 3 А' В О А 3' 5' !ИГР-амплиФикация Рис. 5.24. Синтез генов с помощью ИЦР. Перекрываю!пиеса олигонуклеотиды (А и В) отжигают и достраивангг образовавшийся дуплекс с заглублепными 3'-гидроксильнылш концами.
Двухцепочечные молекулы ленатурируют, добавляют в реакционную смесь вторую пару олигонуклеотидов (С и О), перекрывающихся с пролуктам и первого раунда П ЦР, и отжп тают. Осуществляют аз орой раунд П Ц Р, добавлянгт следую! цую пару олигонуклеотнлов (Г и Р), осуществляют третий раунд ПЦР и т. д. В результпГе образуется лвухцспочечная ДНК. идентичная искомому гену. Олинаковыми буквами со штрихом или без (А' и А„В и В и т. л.) обозначены комплементарные участки ДНК. Нуклеотиднал последовательность каждого олигонуклеогида соответствует таковой определенных сегментов ДН К.
Химический синтез, определение нуклеотидной последовазельности н амнлнфнкяцняДНК 101 С" А Добавление оянгонукяяогнлов Г я Р Денязуряння/аткиг С А 5' 3 Е!ЦР-ямплифияя~~яя С А 3' -5' А В' Е С Е' С' А' | В Дянятуряни я/яаяяг А В' ! 1Е1Р-ямплнфнкяння Рис. 5.24.
(//додал ягенгге) :! Тат/. По завергиении нескольких раундов ПЦР, в которых использовались указанные выше праймеры, добавляют вторую пару праймеров, которые связываются цо соседству с двумя первыми. Такие тесно расположенные праймеры называяпся внутренними. Вторая цара праймеров необходима, поскольку без них нельзя амплифи- цировать полноразмерную молекулу-мишень.
Конечным ПЦР-продуктом является кДНК, соответствующая 3 -концу искомой мРНК. В случае 5'ВАСЕ праймером для синтеза первой цепи кДНК служит Ез5Р (рис. 5.23). Ново- синтезированную цепь обрабатьтвакп концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой в присугст- 102 ГЛАВА 5 вии <)АТР. Этот фермент случайным образом присоединяет дезосирибонуклеотиды к 3'-концу цепи.
Поскольку в данном случае в реакционной смеси присутствует только <)АТР, на этом конце появляется цепочка адсниновых остатков— ро!у(А)-хаос<. С ним спаривается праймер Р-о!1яо(<П ), инициирующий синтез второй цепи. Проводят ограниченное число раундов ПЦР с указанными праймерами, а затем добавляют вторые праймеры и амплифициру>ог кД1.! К, отвечающую 5'-концу мРН К. ВАСЕ-метод широко применяется по рялу причин. Обычно бывает очень трудно обнаружить кДНК, соответствующую мРНК, которая присутствует в данной ткани в маленькой концснтрапии. С помощью КАСЕ-метода можно быстро получить кДНК, отвечаклцие концевым участкам этой мРНК, и при необходимости использовать их в качестве зондов для скрининга кДН К- и геномных библиотек.
Кроме того, поскольку неполноразмсрные 3'-концевые фрагменты кДНК значи гельно преобладают над полноразмерными, 5'КАСЕ может восполнить недостающие 5 -концевые се~менты. Синтез генов < ппл<ощыо ПЦР Получение юнов с помощью П ЦР— <ораздо более быстрый и экономичный мстол, чем т<>т, который основан на отжито олигонуклсотидов с перекрывающимися концами, заполнении брешей с помощью ДНК-полимсразы и сшивании разрывов ДНК-лигазой. В олной из мстолик конструирование гена начинается с отжита двух перскрываклцихся олигонуклсотидов (А и В), отвечающих центральной части гена (рис.
5.24). После отжи<а образуется дуплекс с заглублен- ными 3'-гидроксильными группами„служащими точками инициации синтеза комплсмснтарных цепей при ПЦР. Затем в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотила, С и Рл 3'-конец олигонуклсотила С идентичен 5'- концу олип>нуклсотида А, а сам этот олигонуклсотид отвечает участку конструируемого гена, непосрслсгвснно примыкающему к его центральной части слева. Аналогично, 3'-конец оли< онуклсотида Р илснтичсн 5'-концу олигонуклсотида В и отвечает участку гсна, примыкающему к що центральной части справа. После лснатурации смеси и отжига образуются дуплексы с протяженными выступающими одноцспочечными сегментами, достраивающимися с 3'-концов.
В ходе последующих раундов ПЦР образуется двухцепочсчный пролукт, состоящий из указанных выше сегментов, расположенных в порядке САВВ. Молекула ДНК с заглублснными 5'-концами не достраивается. На следующем этапе в реакцщ>ннук> смесь добавляют еще лва олип>нуклеотила, Е и Е. 3'- конец олигонуклсотида Е идентичен 5 -концу олигонуклсотида С, а сам он отвечает участку реконструируемого гена, примыкающему слева к се< менту С. Аналогичными свойствами обладает олигонуклсотид Г, сели его соотносить с олип>нуклсотидом Г>.
После ленатурации и рспатурации смеси образовавшиеся луплсксы с выступающими одноцепочечными участками достраиваются с 3'-гидроксильных концов. В ходе последующих раунлов ПЦР образуется двухцепочечный продукт ЕСАВПР. Следующие пары оли<оную<сотидов — олин «достраива<ощий» ген слева, другой справа— последовательно добавляют в смесь до тех пор, пока нс будет синтезирован всеь ген.
Длина этих оли<.онуклеотидов обычно бывает равна 50 звеньям. Каждый <блок> ПЦР состоит из двадцати 4-минутных раунлов. Для синтеза гена длиной 1000 п. и. нужно 10 «блоков>, так что геи можно полу <ить в течение одного дня. При этом, как и в случае синтеза генов другими методами, <п>следнюю пару нуклеотидов (т. с. 5'- и 3'-концы) можно снабдить лополнитсльными последовательностями, фланкирую<цими кодирующий участок и обло< чаюц<ил<и п<>следующее встраивание гена в вектор. ЗАКЛЮЧЕНИЕ К числу наиболес важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвснирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Цельк> химического синтеза является получение одноцепочечных молекул ДНК ш г«го. Успеха здесь можно достичь только при высокой эффективности образования фосфодиэфирных связей.
В противном слу "<ае по окончании Химический синтез, определение нуклсотидной последовательности и амплификацияДНК !03 процесса будет получено очень нсболыцос число молекул нужного размера. Длина синтезированных ш»!1го молекул обычно составляет 20 — 30 нуклеотидов и редко превышает 100 нуклсотидов. Для получения двухцспочечных молекул комплементарныс цепи синтезируют по отдельности и затем провод>п отжиг. Полученную таким способом ДНК используют в качестве зоилов для скрининга геномных библиотек; в качестве линкеров и адапторов при клонировании генов; для мутагснсза ш г!1го; для конструирования генов с целью последующего клониро>лзния.
Очень часто для решения биотехнологических и некоп>рых других задач бывает необходил>о знать полную нуклсотидную последовательность клонированно>о юна. Для секвснирования используют несколько методов, один из них — дидсзокси-метол, разработанный Сантером и др. В его ос»овс лежит остановка синтеза испи после присоединения к ней дндезоксинуклсотида. у такого нуклсотида отсутствует 3'-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится нсвозможнь>м.
Для ссквенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая — в присутствии одною из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-элсктрофорсза, проводят радиоавтографию и»считывают» с ралиоавтографа нуклсотидпую последовательность синтезированного фрагмента ДН К. Для ссквенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивактг фрагмент ДН К длиной до 500 нуклеотидов, который хотят ссквенирс>вать. Эту рскомбинантную ДНК легко получить в одноцспочсчной форме н использовать сс в качестве матрицы для ссквснирования вставки. Можно использовать также двухцспочсчные плазмиды, содсржап>ие клонированную ДНК. Для определения нуклсотидной послсдовательности протяженных клонированных сегментов сначала подбирают синтетический олигонуклеотидный праймер, комплсментарный участку, соседствующему со вставкой, и с полющью лилезокси-метода ссквснируют первые 250 — 300 нуклеотидов.
Зател> по результатам секвснирования синтезируют второй праймср и определяют последовательность следующих 250 — 350 нуклеоти- дов клонированшно участка, и т. д. Этот метод, называемый' «праймср-опосредованной прогулкой» (или <блуждающей затравкой»), позволяет секвенировать протяжснныс фрагменты ДНК без их субклоннрования, как в случае системы на основе фага М13. Метод ПЦР произвел настоящую революцию в биотехнологии. Он поз>х>ляет в миллионы раз амплифицировать т >т1го нужныс сегменты ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
