Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, ИМАТР, г)СТР, г)СТР и дТТР (один из них — изотопно меченный), и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ббАТР, г)аСТР, дг)СТР или г)дТТР). Концентрацию каждого дидезоксинуклеотида подбирают таким образом, чтобы он оказался включенным по всем позициям в смеси растущих цепей, а не только в первой встретившейся ему позиции. (Напомним, что после присоединения дидезоксинуклеотида рост г!спи сразу останавливается, / Мазрияиая цсць о / СН А.Т Растушая цепь О Н Н Н Н О Н l Π— Р=О ~-.Я Фосфодизфириая Ф~ связь О Р 1 о С.
:С Присоедиияююийся Н Н сгчт Р Н Н ОН Рис. 5.12. Синтез ДНК в обычных условиях. Очередной дезоксирибоиуклеотид (дезоксирибонуклеознатрифосфат; с)ГзТР) спаривается с комплемеитарныц нуклеотидом матричной цепи. Между 3 -гидроксильцой грушюй последнего цуклеотида а расгущей цепи и а-фосфатной ~рупг1ой присоединяемого нуклеотила образуется фосфоди эфирная связь. поэтому каждая цепь оканчивается 3'-дндезоксинуклеотидом.) По окончании ферментативного синтеза при участии ДНК-полимеразы в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигануклеотндов, каждый из которых содержит праймерную последовательность (рис. 5.14).
Далее в пробирки добавляют формамид, чтобы обеспечить расхождение цепей, и проводят электрофорез в палиакрилалгидном геле на четырех дорожках (по числу пробирок). Это поз- Химический синтез. определение нуклеотилной последовательности и амцлификация ДНК 9! Π— Р=-О О СН Л.Т О l Π— Р=О О СН диле»о«си нухл«ьч ил ;Н„Н Остановка синтеза П рай мер 1 2 14! 67 89 г Матрична» цепь Реахггионвал смесь Праймер и Лоси!о«ильч врслелоьазельносгь Праймер и ллина Логтроевнг!й посл»лов»зелья ости Праймср-дОдСГЫЛ Ираймер-дОдедЛ Грдедсддл Ирзймер-г1ОдСдЛгГРдСг1ОдлддЛ ддЛТР+ чегмре дИТР Праймер «3 ! 1раймер+7 Пра!!м«р -г.х Рвс. 5.!4. Удлинение праймера при синтезе цепи вприсутсгвии лилезоксинуклеотилов.
В каждой из четырех пробирок образуется уникальный нагюр олигонуюгеотилов разной длины. вк.начавших праймернуго послеловательность. При злом образуется и какое-то чисгго полноразмерных молекул ДНК. дучТР— дезоксипук- леозилтрифосфат гЫСТР+ чегыге с!МТР Праймер ч 2 Прагтиер+5 Ираймер-дОгЫС Праймср-г1ОдСдлгГЫдС ддггтр.г.
чечыре д!Ч'!'Р Пр й ернЫО П райнер дОдСдЛдТдСгЫО Праймер+1 Г!Р»ймер ч В Пр»ймер-дОдСдлдгп Прайм«р-дОдСдЛГПЫСдОдлдлдд Г Ираймер+4 П рай мер + 9 ддТ! Р-г ч«пхр«дГ4ТР Рвс. 5.13. Осзановка синтеза ДН К после присоединения лилезоксинуклеотида к концу расту!цей цепи. Фосфолизфирнал связь между концевым лнлезоксинуклеотилом и слелуюц!им нуклсотилом не может образоваться из-за отсутствия 3'-гихроксильной группы. валяет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК, даже соли они различаются по длине всего на один нуклеотид.
На ралиоавтографе обнаруживается набор палас, отвечающих меченым фрагментам ДНК, сопостаьшснис которых позволяет прямо «прочитать» нуклсотидную последовательность секненируемага сегмента ДНК. В примерс, приведенном на рис. 5.15, первые шесть нуклеатилон этого сегмента„начиная с 5— конца, — это АОСТСС. Самая «быстрая» полоса (радиоактивно меченный фрагмент в самом пизу геля) соответствует самому короткому фрагменту и находится в дорожке гЫАТР; следующие полосы располагаются соответственна н дорожках гЫОТР, ИСТР, ддТТР и т.
д. На большинстве ралиаавтографон четко различаются от 250 до 350 полос. Праймерная последовательность находится на фиксированном расстоянии (10 — 20 нуклеагнлов) от того сайта, по которому встроена клацированная ДНК, что позволяет легко распознать начало кланированного фрагмента. Секвенирпвание ДггК с помощью вектора на основе ГГзага М!3 Для определения нуклсотидной послсданатсль- насти клонированных ДНК используются раз- ные подходы.
Один из первых основывался на 92 ГЛАВА 5 ЫАТР Ыстр ЫСТР «ЫЗТР 3' Т Рис. 5.15. Схематическое изображение радиоавтографа, получающегося при секвенироваиии ДНК с помощью дидезокси-метода. В каждую из лунок вносили солержимое одной из четырех пробирок, в которых иаходилси олин из Лилезоксиыуклеотилов: «ЫАТР, «ЫСТР, гЫОТР или гЫТТР. Нуклеотилная послеловательиосзь считываегся с радиоавтографа снизу вверх. На рисунке оиа приведена справа. применении фага М13 Е. сай в качестве вектора. ДНК этого фага представляет собой одноцепочсчнукз кольцевую молекулу. Когда им инфицируют Е. са//, сначала образуется двухцепочсчная рспликативная форма фаговой ДНК, а одноцепочечные кольцевые молекулы, которые затем упаковываются в вирионы, синтезируются на этой двухцспочечной молекуле как па матрице.
Клезки, инфицированные М13, нс подвергаются лизису; в них непрерывно образуются новые одноцспочечные молекулы ДНК М!3, которые, проходя через клеточную мембрану, одеваются белковой обозючкой и выхолят в окружающую среду. ДНК М13 содержит несушсственную часть, которую можно заменить нужным фра|- мензом ДН К; при этом инфекционность реком- бинантных вирусных частиц сохранится. М13- система имеет следующие преимущества: вьшсленная двухцепочсчная репликатнвпая форма может функционировать как плазмида, а одноцепочечная фаговая ДНК вЂ” использоваться в качестве матрипы для ссквенирования ДНК. Все это позволяет использовать фаг М13 как комбинированную систему для клонирования и ссквенирования ДНК. Обычно нужный фрагментДНКдлиной примерно 500 п.
н. встраивакп в полилинкер„который является частью клонированного в РФ-ДНК фага М!3 модифицированного гена /асУ'. Рекомбинантной вирусной ДНК трансформируют компетентные клетки Е. со// и высевают их на чашки со средой, содержашей субстрат Х-Оа1. При его гилролизе 13-галактозидазой образуется продукт, имеющий синюю окраску. На чашках появляются белые (бесцветные) и синие колонии. Псрвьге отвечают клеткам, инфицированным фагом М13 со вставкой, иарушивцзей рамку считывания гена /асУ', вторые — клеткам, инфицированным фатом М!3 с функциональным геном /асУ', нс несущим вставки. Из белых колоний выделянп фаговые частицы, а из них — одноценочсчную ДНК со вез авкой (рис.
5.16). Для секвенирования последней озжигают выделенную ДНК с праймсром, который гибридизуется с последовательностью вблизи вставки, затем проводят дипезокси-секвенирование, электрофорсз и радиоавтографию и «прочитывают» нуклеотидную последовательность вставки. Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (примерно 2000 п. н.) используют другие стратегии. Одна из них состоит в следующем. Встраивают этот фрагмент в соответствующий плазмидный вектор и строят его подробную рестрикпионную карту.
Идентифицируют перекрывающиеся фрагменты вставки длиной от 100 ло 500 п. н., субклон ируют каждый из них в ДНК М13, секвенирукп и воссозлают нуклеотидную последовательность всего исхолного фрагмента. Чтобы быть уверенным в правильности полученного результата и идентификации какого- либо нуклсотида, необходимо секвенировать обе цепи по нескольку раз. Ссквснирование обеих цепей облегчается тем, что кажлый из субклонированных фрагментов исходной ДНК может быть встроен в ДНК М13 в противоположных Химический синтез„определение нуклсотилпой последовательности и амплификация ДНК Полнлинкер Встраиваемый ЕЛ фрагмент ДНК щ ьч Рвс.
5.16. Использование бактервофаг а М13 ляя клонирования и секвеннровання. А. Встраивание фрагмента ДН К в лвухцелочечную регглвкативную форму ДНК М!3. Б. Секвеннрование комплемегпарцых цепей клонированного фрагмента ДНК с помошью олного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе. ориентациях. В результате в одном случае праймср будет иницировать синтез первой цепи, а в другом -- второй. Прайлгер-опоередовапная прогулка («Блуждагоа(ая затравка») Для сслвснирования очень длинных фрагментов ДНК (>5000 п. и.) описанный выше подход уже не может быть использован, поскольку число М! З-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцспочечных плазмидных ДНК, нс требующие субклонирования. Плазмиднуго ДНК, содержащую нужную вставку, выделяют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймсром, который гибридизуется с послсдовательносп ю в олной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки.
Затем осуществляют днлезокси-ссквснирование, позволяющее идентифицировать первые 250-.350 нуклеотпдов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвсннруют следующие 250 — 350 нуклеотилов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклсотидную последовательность следующих 250 — 350 нуклеотидов (рис. 5.17).
Эту процедуру, называемую праймср-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвепируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. К сожалению, в результате ошибочного спаривания праймера заланной длины с более чем одним участком внутри вставки могут быль получены неоднозначные результаты. т!тобы избежать этого, используют праймеры длиной не менее 24 нуклеотидов и стараются строго соблюдать условия отжига. Именно таким образом были секвенированы фрагмшгття ДН К, клонированные в бактериофаге 3. (-20 т.
п. н.) или в космидном векторе (-40 т. п. н.). Некоторыс этапы этого процесса недавно были автоматизированы. Это позволило проводить рутинное ссквенированис фрагментов длиной несколько десятков тясяч пар нуклеотидов. Во многих случаях праймеры, добавляемые в реакционную смесь в разных пробирках, мстят различными флуоресцентными красителями с разной длиной волны флуоресценции. Затем содержимое всех четырех пробирок соединяют и проводят электрофорез на одной дорожке.
Дорожку сканируют в луче лазера и регистрируют 94 ГЛАВА 5 Плазнвлная ДНК РЗ ОН У ! ° | Кгюнарованная ДНК ОИ / ! положение каждой флуоресцируюшсй полосы. Все данные вводят в компъютер, который сопо- ставляет их и выводит на дисплей нуклеотидную последовательность. Полнмеразная ценная реакция Полимеразнал цепная реакции (ПЦР) — это эффективный способ получения !и у!!го большого числа копий специфических нуклсотидных последовательностей. Их амплификацил — иногда в миллионы раз — осущесгвллется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для Пг[Р необходимы: ! ) два синтетических олигонуклеотидных прай мера (длиной примерно по 20 пуклеотидов) „ комнлементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишенгд их 3 -пгдроксильньгс концы после отжита с ДНК должны быль ориентированы навстречу друг другу; 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 000 п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
