Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 19
Текст из файла (страница 19)
соИ в бактериальной клетке оказывается линейная молекула ДНК с соз-концами, козорыс спариваются ярус с другом. ДН К-лигаза кзетки-хозяина зашивает одноцепочечныс разрывы, и образовавшаяся кольцевая молекула существует в клетке-хозяине как автономно реплицирующаяся единица. Трансформированные клетки можно идентифицировать по признаку устойчивости к тетраци клину. ся три фрагмента. Так называемое левое плечо (область !..) солержит генетическую информацию о головке и отростке фага, пряное плечо (область К) ведает репликацисй ДНК и лизисом, а средний сегмент имеет гены, ответственныс за процессы интеграции и исключения (сегмент 1/Е, от англ.
!и!ейга!!оп/ехс!з!оп). Задача исследователя состоит в том, чтобы заменить этот центральный участок нуклеотилной последовательностью длиной г!рг!мерно 20 т. п. н. (рис. 4.17) нужной ДНК. ДНК, предназначенную для клонирования, тоже расщепляют с помощью ВащН1 и выделяют фрагменты размером от 15ло 20 т. и, и. Оба препарата — фаговую и чужеродную ДН К вЂ”. объединяют и добавляют ДН К-лигазу фага Т4, а затем— пустые головки и уже собранные отростки. Фрагменты ДНК длиной 50 т.
п. н. упаковываются в головки, к ним присоединяются отростки н образуются инфекционные фаговые частицы. Фрагменты большего (>52 т. и. и.) или меныцсго (<33 т. и. н.) размера упаковываться не могут. Рекомбинантный фаг 2 может размножаться только в тех штаммах Е. со!1, которые не обеспечивают размножения фага ). с интактной областью 1/Е. Для сохранения рскомбинантного фага ). с! о периодически пересевают на свежую культуру Е. со!г'.
Для скрининга библиотек на основе фага ). можно использовать ДНК-зопды или имму!юлогические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тсстиру!от. Если используется ДН К-гибрилизация, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодирусмые клонированными генами, Векторы, называемые космидами, могут включать ло 40 т. п. и. чужеродной ДНК и при агом активно амплифипироваться в Е саВ как плазмилы. Космиды объединяют в себе свойства плазмилных векторов и векторов на основе фага )..
Например, широко применяемая космида РЕЕК-5 (приблизительно б т. п. н.) имеет два соз-сийга фага 2, разделенных сайтом рестрикции для 5са1, полилинкер с шестью уникальными сайтами рестрикции (Н!аг)Н1, Рзг!, Еа!1, ВатН1, Еша! и Есай!), точку начала репликапии ДНК (оп) и геп устойчивости к тетрапиклину (Те!'). Эта космида может интегрировать чужеродную ДНК длиной ло 40 т. и. и. (рис.
4.18). Предназначенные для клонирования фрагменты ДНК длиной около 40 т. и. н. очищают цснтрифугированисм в !ралиентс плотности сахарозы от продуктов частичного гидролиза Лонорной ДН К рестриктазой ВатН! (рис. 4.18), а РЕЕК-5 сначала гюдвергают гидролизу с помощью Вса1, а зияем ВаглН1. Препарапя ДНК смешивают и лигируют. Те продукты лигирования, которые солержат вставку длиной 40 т. п. н., имеют суммарный размер, близкий к 50 т. и.
и., и слеловагсльно, могут упаковываться и у!гго в головки фага Х. Реассоциировавизие молекуль! р) ГВ-5, Тех!со!сот!си рековсбннантссых ДНК 75 Валс ссс' с Васы Н); выделанно фрагментов длиной -40 т. п. н. ~ЛЛР5ЛЛЛЛЛЛЛЛЛРЛУ ВаасН! ВаасН! Головка ток тростка ИифсссСировассив ~ Нагая Упакованная в соловку вахта!сная Д!!Калин~я 50 т 50т. и. н. Упаковка сл Мно сся-Коне!с ННК, фрагменты кпсс!ротс предполагается пронять тб ГЛАВА 4 нс содержагцие вставок, упакованы не будут. После сборки фаговых частиц инфицирук1т ими Е.
сои(рис, 4.!й. Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула р(.РК-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию сов-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком; нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют н другие космидные векторы на основе фага Х. Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмнлами: в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания гсномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг.
Векторяые системы для клонирования очень круг!нык фрагментов ДНА' Векторныс системы, способныс инте~рировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имекл большую ценность при анализе сложных эукариотических гсномов. Без таких векторов нс обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет прелставлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генон булет присутствовать в «свосм» клоне.
Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. и. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. и., на основе Р-плазмиды (Г-фактора, или фактора фсртильности) Е. со!Г, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой !асг.' векторов р()С.
Эта конструк- ция называется бактериальной искусственной хромосомой (ВАС, от англ. Ьасгепа! ага!)сГа! сйгатовотез). Генетическая трансформация прокариот Перенос ДИК в Е. со!! Трансформация — это процесс введения своболной ДНК в бактериальную клетку. Е. соя используется в качестве организма-хозяина при работе со многими рекомбинантными ДНК, н чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором СаС1, а затем выдерживают при 42 'С в течение 1,5 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки.
Этот мстол даст максимальную частоту трансформации, примерно 10 з, т. е. на каждую 1000 клеток приходится одна трансформированная. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, составляет примерно 10т — 10". Частота трансформации никогда не бывает 100-процентной, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки. Клетки, способныс поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Компетентность Е соб нсобхолимо индуцировать, а некоторые другие бактерии обладают этим свойством изначально.
Долю компетентных клеток можно повысить, используя специальную питательную среду или условия кулыивирования. Для бактерий, устойчивых к химическим индукторам компетентности или це обладающих природной компетентностью, примснякпся другис системы доставки Д1-1 К. Злектронарация Для увеличения проницаемости клеточных мембран на них воздействуют электрическим током. Эта процедура называется элсктропорацией. Условия се провслсния различаются для разных видов бактерий. При работе с Е. свб клеточную суспснзию (-50 мкл) и ДНК помещают в сосуд с погружснными в него электродами и подают единичный импульс тока длительностью -4,5 мс (емкость конденсатора 25 мкф, Технология рекомбинаитных ЛН К 77 напряжение 2,5 кВ, сопротивление 200 Ом).
После такой обработки эффективность трансформации повышается до 10ч для коротких плазмил (примерно 3 т. п. н.) и до 1Оь для больших (примерно 135 т. п. н.). Аналогичнгас условия можно использовать для введения в Е. сой вектора ВАС. Таким образом, элсктропорация является эффективным методом трансформации Е.
сой плазмндами, содержащими вставки длиннее !00 т. п. и. Есть основания полагать, что подходящие условия электропорапии будут разработаны для всех видов бактерий, так что эта процедура может стать стандартным метоЛом трансформации. О механизме проникновения в клетку ДНК в процессе электропорации известно очень мало. По-вилимому, как и при химически индуцированной трансформации, в результате электрошока в клеточной стенке образуются врсмснные поры„через которые ДНК и проходит в клетку. Коньюгацил Рекомбннантная ДНК проникает в клетки бактерий, характеризующихся низкой частотой трансформации, таким же образом, как плазмилная ДНК из донорской клетки в реципиентпую в естественных условиях Некоторые плазмиды обладают способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в лругую. Образование контактов между донорной и рсциписнтной клетками обеспечивается конъюгатнвными свойствами плазмил„а сам перенос ДНК вЂ” мобилизационными.
Большинство плазмид, которые использук~тся в работах с рекомбинантными ДН К, не обладают конъюгативными функциями и поэтому не могут переходить в рсципиентные клетки путем конъюгацни. Однако проникновение в клетку некоторых плазмидных векторов все-таки происхолит при наличии в этой клетке второй плазмиды, обладающей конъюгативными свойствами.
Таким образом, введя в клетку, несущую мобилизусмый плазмидный вектор, плазмцду с коньюгазивными функциями, можно трансформировать клетки- реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Опишем в общих чертах используемую для этого стандартную экспериментальную проце- дуру. Смешивают клетки трех разных штаммов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
