Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 17
Текст из файла (страница 17)
С помощью гель-злектрофореза и картирования определяют размер каждого фрагмента (вставки) и идентифицируют аналогичные фрагменты или фрагменты с перскрывакпцимися последовательностями. Можно также провести дополнительное клонирование с тем, чтобы составить полный ген из нерекрывакядихся фрагментов. Или, если вставка в каком-либо из клонов достаточно велика и вполне може~ содержать весь ген, провести ес ссквенирование и убедиться в наличии старт- и стоп-колонов и полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующси искомый белок. К сожалению, никто не может пать гарантии, что в библиотеке представлена вся цуклеотидная последоватсльност» нужного гена. Если ~ юиск полноразмерного гена оказался бсзрезультазным, можно создать другую библиотеку, используя другую рестриктазу, и провести скрининг с помощью исходного зонда или зоилов, созданных на основе предыдущей библиотеки.
Чтобы повысить вероятность присутствия в библиотеке полной версии искомого гена, можно также созлать библиотеки, содержащие фрагменты ДНК заведомо большего размера, чем средний размер прокариотического гена (этот вариант мы рассмотрим в данной главе позже). Имл!уиологичеекий скрииииг В отсутствие ДНК-зоида для скринингл геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клоннрованный ген экспрессируется, то его продукт — весь белок или его шсть — можно обнаружить иммунологичс- бе 1 ЛАВА 4 Филю р Колония Чашка итателыюй средой ки Перенос колоний З. Лизис клеток; леназурация ДНК и Фиксация ца Фильтре 4. Культивиров солерж искомух> Фильтр сироваиная ДНК Зонд 3. Гибрилишция Гибрилнзовавц Рис. 4 13.
Скрининг библиотеки геномной ДН К с применением меченого зонда. Клетки после трансформации выссвакзт на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. ! . Переносят клетки из каждой выросшей колонии на гвердую подложку (например, нитроцсллкшозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке. 2. Клетки лизирукп, высвободившуюся ДНК подвергают ленатурации и лепротеинизации и фиксируют на фильтре. 3.
На фильтр наносят меченый ДНК-зонл и проводят гибрилизацию. Смглвают с фильтра негибрилизовавшийся зонд и проводят ралиоавтографик> с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонл. 4. Идентифицируют на чашкс колонии, содержащие искомую ДН К (положительный гибрилизационный сигнал), отбиракзт из них материка и культивирукгп скими методами.
Технически зта пропсдура имеет много общего с гибридизацией. Все клеточные линии (клоны) библиотеки высевают на чашки с питательной средой. Выросшие колонии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят первые антитела. которые специфически связываются с данным белком (ацтигеном), все несвязавшнеся антитела удаляют, а фильтр помещая>т в раствор вторых антител, специфичных в отношении первгях антител.
Во многих тест-системах используют конъюгвты вторых антител с ферментом, например с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторыс антитела связываются с первыгии, то под действием фермента происходит гидролиз субстрата с образованием окрашенного вегцества и том месте, где идет реакция (рис. 4.14). Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный геп, или достаточно прспяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми анти- телами.
По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. Технология рекомбинантных ДНК 69 Чашка с питательной средой Фиксированный Фильтр Фильтр 2. Лизис клеток и Фиксация лка ин Фины !.
Перенос колоний 3. Обработка Филыра первыми аиппелаци ронапие к, аших белок Первые аитигела Ьсхок, сиитезиртьиый чюложизельнцми клеткаии Фильтр Фильтр Вторые аититсяа ьтр 4. Отмывание Фильтра г цесвязавшихс первых антител нанесение вторых антигел 5. Отмывание подложки г иесвязавшихс шорых антител нанесение бесцветного субстрата Рагс 4. (4. Иммунологический скрининг геномной библиотеки (имлзупозюгическое тесгиронанис колоний).
Клетки после транстформаци и вы севают на тнердукз питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. (. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку(например, нигроцслпюлозный или нагйяоновый фильтр) знк, чтобы их расположение в точности соотнстстнонало таковому на чашке. 2. Клетки подвергают лизису, белки фиксирукп на фильтре. 3. Наносят на филю р первые антитела, которые связывактгся только с искомым белком. 4. Несвязаншиеся первые гшггитела удаликзт, нанося г на фильтр вторые антитела, спепифичные в отношении первых антител, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой). 5.
Смывают с фильтра все несвнзаншиеся вторые антитела и наносят на него бесцветный субстрат, при гидролизе которого образуется окрашенный пролукт. Гилролиз может произойти только в присутствии шорых антител. 6. Отбирают колонии на чашке, соотвстствукнпие окрашенным пятнам на фильзрс, и культивирукп их. В ннх может содержаться рекомбинантная ДН К, кодирующая белок, гомологичный первым антитслам. Скригзиггг по активностпгг белка Метод гнбрпднзапнн ДНК н нммунологичсские методы позволяют идентифицировать многие гены н нх продукты. Если при этом искомый геп кодирует фермент, не сиптезнруемый клеткой- хозяином, то для обнаружения клозюн, содержащих данный ген, можно использовать метол идентификации на чашках.
Так были идентнфн- цнронаны гены гх-азцилазьг, эндоглюканазы н )3- галактозндазы различных организмов. Для этого клоны Е го1з', составляющие геномную библиотеку данных оргапнзмон, высевали на чашках с питательной средой, содержащей специфический субстрат. После окрашинания селектннным красителем клетки, способные утилизировать этот субстрат, приобретали характерную окраску. 70 ГЛАВА 4 Если искомый ген кодирует продукт„без которого мутантная клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку можно создать методом трансформации мутантпых клеток.
Клетки, выросшие в отсутствие необходимого субстрата на минимальной среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмндного вектора. В разных вариантах этот полход использовали для выделении многих важных генов, в частности генов, ответственных за синтез антибиотиков и образование азозфиксирующих клубеньков на корнях некоторых растений. Клонирование структурных генов аукариот Для клонирования эукариотических структурных генов необходимы специальные методики. Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-трапскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических мРНК в бактериальной клетке невозможна.
Более того, экспрессия эукариотической ДНК может осугдествляться только при наличии прокариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию. Концевые участки эукариотических мРНК особым образом модифицированы: их 5 -концы кэпированы (содержат «кэп» из остатка О, часто метилированного), а 3'-концы полиадснилировангя (содержат ро1у(А)-«хвост» из примерно 200 остатков аленозина). Наличие ро1у(А)-хвоста позволяет отлепить мРН К от рибосомной и транспортной РНК. Для этого суммарную эукариотичсскую РН К пропускают через колонку, заполненную пелдюлозой, к которой «пришиты» короткие олигопуклеотидные цепочки из тимидиновых остатков длиной примсрно 15 звеньев, о11яо(дТ).
Ро!у(А)- хвосты молекул мРНК спариваются с ойдо(<П ) и задерживаются в колонке„а молекулы тРН К и рР11К свободно проходят через нее, Затем колонку промывают буфером, в ксггором происходит разрыв водородных связей межлу А и Т, и мРНК высвобождается. Саму мРНК нельзя встроить в ДНК-вектор, сначала на ней необходимо синтезировать двухцепочечную ДНК. Для этого последовательно используют две разные полимсразы: обратную транскриптазу н фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
