Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Мав!а!!я. 1994. Ттапяспрйопа1 ясбттатюп: а сошр1ех рига!е тя!тЬ 1етг еаяу р1есея. Сей 77: 5 — 8. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Опишите в общих чертах процесс репликации ДНК. 2. Чем различаются ДНК и РНК? 3. Опишите сходство и различие структурных генов про- и эукариот. 4. Опишите процесс элонгацин полипептидной цепи. 5.
Какова наиболее вероятная нуклеотидная последовательность, кодирующая следующую аминокислотную последовательность: МАООТ%Я~ЕГРВКМ%Х1ЗЯТ! НРГН.РМХУАО. б. Какой аминокислотной последовательности отвечает следующая нуклеотндная последо вательно стек О СОА1ЗСОАСОА1ЗО ШЗ1ЗС !ЗААААО !ЗА1ЗС1ЗСА1ЗСОАААООАООО!3!ЗСО1ЗАА1ЗАОСОАСССОООСОО. 7. Что такое ТАТА-бокс? 8. Что такое оперон? В чем заключается его биологическая роль? 9. Расскажите о трех разных способах ретушяции транскрипции у прокариот. 10. Опишите основные элементы ДНК, ответственные за транскрипцию эукариотических структурных генов.
52 ГЛАВА 4 и Р ~Р Р Р 5 5 5 5 5 5 5 Т !С А А Т Т С! ! А !С Т Т А А С! + -Т -! 1- + 5 5 5 5 5 5 5 НО Р Р Р Р Р Р Расщепление с образованием $ липких концов Р ОН 5 ! Т А 1 Р Р Выступающая 5«фосфитная группа / 5 5 5 5 5 1 1 1 ! ! ! А А Т Т С Т С А ! 1 5 5 НО Р Р Рис. 4 2. Рас!цеплегие короткого фрагменщ ДН К рсстрицирующей зндонуклеазой типа П Етой! с образованием липких концов. Стрелки — связи, по которым происходит расщепление в сахарофосфатном остове. 5 — дезокснрибоза, Р— фосфатная группа, ОН вЂ” гидроксильная группа. Последовательность, распознаваемая ЕгоК!, выделена штриховой линией.
5 5 5 5 $5 5 ! у! — --+ — -1----1 — --1----+ . Т !С Т Т А А С! ! . ! А !С А А Т Т С! «! — --1 — --4----1-- — 4 — --+' .у 5 5 5 $5 5 5 Расщепление с образованием тупых концов Р Р у Р у Р у ОН 5 $5 5 1 1 1 1 А А С Т Т Т С А 1 1 ! 5 5 5 5 Рис. 4З.
Расщеплснис короткого фрагмсггга ДНК рестриктазой типа П И!лбП с образованием тупых концов. С грелки — связи, по которым происходит расщепление в сахарофосфатном остове. Буквенные обозначения — те жс, что и на рис. 42. Последовательность, распознаваемая рестриктазой ИлбП, выделена штриховой линией. Р Р 1 А 1 НО Р «утопленная» 3 -гидроксилъиаы группа ОН 5 1 С С Т Т А А 1 1 1 1 1 5 5 5 5 Р Р Р Р ОН 5 5 5 $ 1 1 1 Т С Т Т А С А А 1 1 1 1 5 5 $5 Р ОН 5 1 Т А ! Р Р Технология рскомбинантпых ДНК 53 и получила назваие ЕсоК1.
Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палипдромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-+3 ) из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденипа в каждой цепи (рис. 4.2), расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-атоме углерода сахарного остатка одного пуклеогида и фосфатной группой, присоединенной к 5'-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаклся наискось друг от друга, в результате чего образуются однопепочечные комплемептарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотиЗюв в каждом (липкие концы).
Каждый одноцепочечный »хвост» заканчивается 5 -фосфатной группой, а 3 -гидрокснльная группа противоположной цепи как бы утоплена. Помимо ЕсоК1, из бактериальных клеток были получены сотни рестрицирующих эндуклеаз типа П. Названия этим эндонуклеазам даются по такому же принципу, как и ЕсоК1: род микроорганизма обозначается прописной буквой, а внд— двумя строчными; штамм обычно не указывается. Римские цифры — порядковый номер данной зндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорзанизма.
Например, Нра1 и НраП вЂ” это соответственно первая и вторак рестрицируюшие эндонуклеазы типа П, выделенные из Нааторп!!их рагаглЯиепеае. Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицируюшими энлонуклеазами типа!! и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания.
Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против лруга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.
! ). От длинь! сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тетра- и гексануклеотиды. Ресгрицирующие эндонуклеазь! типа П играют ключевую роль при генном клонировании. Тасыпча 4.1. Нуклеотидные последовательнее пь распозпапаемыс некозпрыми ферментами рестрикции Ферм»не Скйт Характер узееееепя образуемых кепцее и'л-л-т-т — с с-т-т-л-леп С!Π†.-Т вЂ” С вЂ” С с-с-т-л--с и С вЂ Т вЂ 0-Азс а л--с- с-т — с 'с — л — т-с С-Т--Л-С, с-л-с'с-т-и П Т С!с! А 'С П вЂ” Т вЂ” ТьА -Л вЂ” С с-л-л„т — т — гз ы-сгс-С с — сс — с С!С -С- С-С вЂ” С вЂ” С»-С с — гз-с-с-с и — с,п Вькзупкющие концы с 5 -фое4агпой группой Выегупзющие концы е 5'-феефетнок еруппой Высгупзющие концы с 3'-1зьзрокепльной ~руппой Вьктупщоп!ие концы е 5'-фесфзтпой группой ееощ ия! Наизл! Ряя! Тупые концы Нра! Тупые концы Тупые концы Выгсеупщоп!ие концы е 5 -фоефатпой группой Обработка образца ДН К определенной ресгриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, по расщепление происходит по всем сайтам узнавания.
Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДН К, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции влоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью.
Из этих данных следует, что данный участок ДН К имеет по лва сайта лля ВаупН! и ЕсоКЕ Чтобы построить рестрикциопную карту, следует сравнить размеры фрагментов, полученных при раздельной рестрикции и при рестрикции смесью ферментов. Результат такого сравнения представлен на рис. 4.4,Б. Если при гидролизе ДНК каждой из двух рестриктаз (ЕсоК1 и ВатН1) образуются три фрагмента, значит, в исходном фрагменте ДНК было лва сайта узнавания для каждой из использованных рестриктаз. Фрагмент размером 300 и. н., который образуется в результате гидролиза ЕсоК1, не расщепляется 54 ГЛАВА 4 положенных одна под другов.
Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получаезся смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно сулить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фра~ментов, олновремснно проводят злсктрофорсз маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охыпывать весь диапазон молекулярных масс в ланной системе. Образец маркерных молекул вносят в отдельную лунку, распо.
ложсннукл вблизи одного из кра ев нласгинки (нлн в две лунки у двух разных краса). Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с сто электрофорстической подвижностью В, — величиной, равной отношению расстояний, пройденных марксрной' молекулой и красизелсм (Фронтом растворителя). Построив лрафик зависимся.-ги логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Вг можно найти опюситсльную молекулярную массу каждого компонента образца. Относизельная люл. масса белков измеряется в лальгонах, двухцспочсчных нуклснноаьт кислот — в числе пар нуклеотилов, олноцепочечных — в числе нуклеотщтов. Для разделения белков обычно используют полнакриламилный гель (ПААГ).
Он образуется нри сополимеризаци и акрилами- Гель-электрофорез при гидролизе смесью ЕсаК! н ВатН1 в отличие от ЕсаК(-фрагментов размером 850 и 500 и. н. Значит, два ЕсоК1-сайта находятся на расстоянии 300 и. н. друг от друга и между ними нет ВатН1- сайта, а в ЕсаК!-фрагментах длиной 850 и 500 и.н. есть по одному ВатН1-сайту. Фрагмент размером 950 и. и., который образуется при обработке ДНК рестриктазой ВатН1, ири двойном гидро- лизе расщепляется ЕсоК1 на три фрагмента (250ч 300+400 =- 950 п. и.). Значиг, два ВатН1- сайта находятся на расстоянии 250 и 400 и.
н. ио разные стороны от сайшв для ЕсаК1. ВатН! расщепляет ЕсоК1-фрагмент длиной 850 и. н. на фрагменты длиной 250 и 600 п. н., а один из сайтов для ЕгаК! находится на расстоянии 250 п. н. от сайта для ВатН1, значит, фрагмент 600 и. и. Для раздсяения белков н нуклеиновых кислот широко применяется мсгол гель-элсктрофорсза. Его принцип заключается в слелуюшем. Исследуемый препарат (раствор белка, ДН К или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля — полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза использую~ тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещшогся в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (н одинакового заряда) лвижузея единым Фро~ггом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся.
Постепенно исхолный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распре деленные поплине пластинки. За холом электрофореза следят по перемещению в геле красителя— заряженного ннзкомолскулярнсяо вещества, которос вносят в каждую лунку перел началом элсктрофорсза. Ко~да краситель досз и~нет конца пластины, элсктрофорезостанавливаклт, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками илн нуклсиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после элек~рофорсза получается набор четких полос, рас- да и бисакриламяла, использующегося в качестве сшивки линейных полимеров акриламнда. Размер ячеек в полнакриламилной «сстксл зависит оз концентрации акриламила и соотношения между количеством акриламнда и бисакрнламида.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
