Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 15
Текст из файла (страница 15)
гсвй1-сайт расположен вне этих генов. Длина вектора — 4361 и. н. обработать рестриктазой, расщепляющей ее в еяннственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с лонорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибрилных молекул.
Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присугствии АТР, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов„а также нежелательные продукты, в частности объелннившнеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмндные ДНК. Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают рестрицированную плазмилную ДЕ! К щелочной фосфатазой, отщепляюшей от линеарнзованной молекулы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы лефосфорилированной линейной плазмнлной ДНК (рнс. 4.8). Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них я имеются Лва ояноцепочечных разрыва, ее фрагменты улерживакп ся вместе двумя фосфолиэфнрнымн связями, образовавшимися с помощью ДНК- лигазы между Лефосфорилнрованной плазмгщной ДНК и рестрнцнрованной лонорной ДНК (рис. 4.8).
После репликапии в трансформированной клетке одноцепочечпые разрывы устраняются системой лнгировання клетки-хозяина. Транс4армацил и отбор Теперь необходимо ввести рекомбинантную ДНК в клетку-хозяина. Этот процесс называется трансформацией. Для его осуществления используют специально разработанные приемы, например полвергают клетки высокотемпературному возлействию и обрабатывают нх хлористым кальцием (СаС1,), Олнако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки нз тысячи. Таким образом, большинство клеток после провеяения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК.
В некоторых из них появляется воссоелинившаяся кольцевая плазмилная ДНК, избежавшая лефосфорнлирования щелочной фосфатазой, в Лругих — неплаз- Технология рскомбинантных ДН К 59 Доисривя ДНК Пдвзмидивв ДНК Рестрикция Рссгрикция Обработка щсвсчива Фосфвтвзой Р ГЛЯ.ЙУ~ПЛ Он НО ХМ 0'ЛЛгТР НО ОН ОН О О й Фвсфсдиэфиривя Р связь / х Одисцсисчсчцыа разрыв Трансформация Клетки-хозяин Рис. 48. Встраивание чужсролной ДНК в цлазмвлный вектор.
ИлазмиднуюДНК, обработанную ресзриктазойз и щелочной фосфатазой, смсшнвщиг с рссгрицированной ланорной ДН К, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из чстырсх одноцсиочсчных разрыва при этом устраняются, н конструкция оказывается стабильной благоларя образовавшимся фосфолиэфнрным связям. После ввслсния гибрилной ДНК в клсткухозяина происходит се рецликация и образуются новые кольцевые молекулы уже без разрывов. мидная ДН К и лишь в некоторых — плазмида со встроенным фрагментом чужеродной ДНК ~гибридная плазмила).
Как мы уже говорили, внехромосомная ДНК, не содержащая точки начала репликации„не может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом, проникновение в клетку экзогенной ДНК еще не означает, что она будет поддерживаться в хозяйской клетке. Далее, лля сохранения рекомбинантной ДНК в клетке-хо- 60 ГЛАВА 4 зяте в первоначальном виде необходимо, чтобы в клетке отсутствовали гены, кодирующие сигпез рестриктаз, которые могут привести к ее деградации„и чтобы клетка имела фенотип КесА (такие клетки неспособны к обшей рекомбинации, так что экзоге иная Д Н К не будет модифипироваться в результате гомологичной рекомбинации). Затем необходимо илентифицировать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК.
Способ идентификации должен быть как можно более простым, поскольку приходится проверять огромное число клеток. В системе рВ К322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт ВатН1, специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду„содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, и которых присутствует интактный ген Ашр' — или в составе интактной плазмиды рВК322, или в составе 4ибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт ВатН! расположен в гене Тей плазмиды рВК322 (рис.
4.7); встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетраци клину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, 4ю чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду рВК322„несут ген Тег' и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину. На втором эчапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки.
Клетки„образующие колонии на чашках с тетрацнклином, содержат янтак гнук4 плазмилу рВК322, поскольку, как мы уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чщпках с тетрациклнном, чувствительны к этому а44тнбиотнК, значит, оци содержат гибридную плазм иду р В К 322. Среди колоний„выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объели!!лют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вме- сге.
Далее можно провести дополнительный скрининг и идентифицировать те клетки, которые несут гибридную плазмиду рВ К322 со специфической всзавкой. Присутствие сайтов Н!ийИ! и Бай в гене Те1" и сайта Рвг! в гене Ашр' плазмиды рВК322 позволяет изменить локализапию клонированных фрагментов чужеродной ДНК. Если для встраивания используется сайт Р4г1, то отбор проводится по той же схеме, но в другом порядке, т.
е. сначала высевают клетки на среду с тетрациклином, а затем — с ампициллином. Другие илаз иидиые векторы Идея использовать рВК322 как вектор для клонирования была вполне удачной, но эта плазмида содержит лишь несколько сайтов рестрикции, а отбор трансформированных клеток занимает много времени. Это привело к необходимости раз14аботки альтернативных систем клонирования. Например, плазмила р() С! 9 лли ной 2686 п. н.
содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена 4)-галактозидазь4 (!асг') лактозного оперона К сой; ген !асД кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена !асУ", цолилинкер — короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (ЕсоК1, Вас), Кра!, Хта), Вта1, ВатН1, ХЬа1, ВаН, НюсИ, Асс!, ВзрМ1, Рл41, .5р!4! и Ник1И!); точку начала репликации нлазмиды рВК322 (рис.
4.9). я 4асг' Полилянкер Аюр" Ген и!о! 4иа!4ия реплнкзцаи Ряс. 4.9. Генетическая карта плазмилного вектора рг4С19. Плазмила состоит из 2686 пар нуклеотидов и содержит уникаль44ые сайты узнавания для ЕооК1, .5аг1, яро!, Хтаг, Ь)па1, ВатН1, Хоа1, Бай, Наюц, Агс1, Рз41, ВхрМ1, ар!41 я Нго441П, локализованные я поли- ЛИНХЕРЕ; ГСН УетайЧяаОС4Я Х аМПИЦИЛЛИНУ„райт ИНИ- цяации репликации, функционирующий а Е. со!4; ген !ос!, контролирующий синтез репрессора, которыя блокирует транскрипцию гена 4асЕ' в отсутс4вяе инлукто4Х4 ИПТГ.
Ч ехнологин рекомбинантных ДНК 61 При расщеплении ДЕ(К рестриктазой К! образуются фрагменты с липкими концами ).Е. Мог!х, К.УУ. 0ах!з 2»ссс. 71аа Лсоа ясе о5Л69: 3370 — 3374,!972 цирующего сто вируса (бактериофага) обусловливается наличием в клетке фсрмента, ко~орый раси!еплнет фаговую ДНК. Позже Мерц и Дэвис установили, что этот фермегп, рсстриктаза К! (получившая название ЕсоК!), расщепляет молекулу ДНК в специфическом сайтс с образованием комплементарных (« липких») концов. Линейные молекулы, образовавшиеся при расщеплении кольпевой ДНК рестриктазой ЕсоК1, часто вновь замыкаютсн в кольцо бна~одарн спариванию комплементарных концов.
Обьединившисся фрагменты удерживаются вместе водородными связями; их концы можно ковалентно сшить. добавив фермент ДНК- держаших немоднфнцнрованную плазлл иду р()С19. Для клонирования в рО!С19 донорную ДНК расщепляют одной из рестриктаз, чей сайт находится вполилннкере; )шазмиднуюДНКпьзролизуют такой же рестриктазой, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. Обе ДНК смешивают в присутствии ДНК-лнгазы Т4 н используют образовавшийся продукт для трансформации к!сток, которые могут синтезировать ту часть ))-галактозидазы ()асс.ц), которая соединяется с продуктом гена 1исЯ с образованием активного фермента. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллнном, ИПТГ и субстратом для р-галактозндазы. Нетрансфомированные клетки не могут расти в присутствии ампнцнллнна, а клетки, несущие интактпую плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную плазмнду, образу!от на той же самой среде белые колонии„поскольку обычно при встраивании в полнлинкер чужеродной ДНК Прн отборе трансформированных клеток руководствуются следующими соображениями.
Если клетки, содержащие пемодифицнровапную плазмиду р\3С19, выращивать в присутствии изопропнл-))-0-тногалактопнранознда (ИПТГ), который является ицдуктором 1асоперона, то продукт гена (ас7 не сможет связаться с промоторпо-операторной областью гена 1аса', и как следствие будут происходить транскриппия и трансляция плазмидного фрагмента гена 1аса . Продукт этого фрагмегпа свяжется с белком, коднруемым хромосомной ДНК, н в результате образуется активная ))-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полнлнпкер) встроена в ген 1асж так, что она не влияет на продукцию функциональной Р-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор- 3-индолил-р-Р-галактопнранознд (Х-Оа!), то он буде~ гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, со- Технология рскомбннантных ДН К включаег создание вектора— «переносчика» клонируел!ой ДНК, специфическое встраивание в него этой ДНК с образованисл1 химерной конструкции, введение конструкции а клетку- хозяина и идентификацию клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
Незаменимым рабочим инструмснзом а зтнх манипуляцинх являются рестрицируюшис эндонуклеазы типа Н. Нх применяют как при создании векторов (см., например, Войчаг е! а1., бене 2: 95-113, 1977), так и при встраивании в них нужных генов. В 1968 г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
