Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Когла клетки оказываются в непосредственной близости друг от лруга, конъюгативная плазмида, которая в данном случае обладает также мобилизационными свойствами, сама переходит в клетку, содержащую мобилизусмый плазмидный вектор, а затем обеспечивает перенос векторной ДНК в реципиентную клетку. В такой системе реализуются вес возможные пути переноса, но подобные штаммы и плазмиды обладают такими генетическими свойствами, чтобы можно было отобрать рсциписнтную клетку, получившую данный плазмидный вектор. Предположим, ч го мы имеем три штамма: 1) штамм А, который несет коныогативную мобилизусмую плазмиду, но не может расти на минимальной питательной среле и чувствителен к антибиотику Х; 2) штамм В, который также не может расти на минимальной питательной среде и несет неконъюгативный плазмидный вектор, который имеет ген рсзистентности к антибиотику Х; 3) штамм С вЂ” рецепиентная клетка-мишень, которая может расти на минимальной среде, не имеет несовместимых плазмид и чувствительна к антибиотику Х.
После конъюгации клетки непродолжительное время выращивают на полноценной среде без антибиотика Х, а затем переносят их на минимальную среду с антибиотиком. В этих условиях могуг расти только рсцнпиентныс клетки-мишени, которые приобрели плазмгшный вектор. Иногда клетка-мишень гюлучает обе плазмиды, однако этот редкий случай можно выявить, если перенести клетки путем перепечатки на минимальную среду и отобрать трансконькзганты, которые способны расти в присуствии антибиотика Х, но нс могут расти при наличии гена резистентности к другому антибиотику (например, к антибиотику У), который имеется в кон"ьюгативпой плазмидс штамма А.
Поскольку для переноса плазмидной ДНК должна произойти-конъюгация между тремя бактериальными ппаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. Технология рекомбинантных ДН К включает целый набор экспериментальных процедур„благо- 7Х ГЛАВА 4 даря которым удается выделить (клониронать) фрагменты ДНК, содержащие специфические гены. Успех клонирования зависит от возможности воспроизводимо разрезать молекулу ДНК на фрагменты определенного размера.
Для точного расщепления ДНК используют рестрициругощие эндонуклеазы типа !1. Эти Ферменты узнают специфические нуклеотилные последовательности и симметрично разрезают фосфолиэфирные связи в каждой цепи. Типичный эксперимент по клонированию генон включасг следующие этапы. 1. Рсстриктазнос расщепление ДН К, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного). который может реплипироваться в клетке-хозяинс, теми жс рестриктазами, которые использовались для расгпеилсния донорной ДНК.
3. Смешинание этих двух образцов ДНК и сшиваннс фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клетокхозяен. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменыпить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся при сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДН К обрабатывают щелочной фосфагазой, удаляюшсй 5 -концевые Фосфатные группы.
Для отбора трансформированных клеток, содержа!них гибрилные плазмиды, проводят: 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию; 2) иммунологичсские тесты или вьтнление специфического белка — продукта клонированного гена; 3) гибридизацию с зондом, комплементарным какому-либо участку искомого гена. Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично, При этом получаются Фрагменты разной длины, из которых затем созлают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на осноне бактериофагов Х и Р1, а также плазмиды Р.
Для получения фрагментов ДН К, копирующих эукариотические белки, на очищенной и РН К как на матрице синтезируют комплемснтарную цепь ДНК с помощью обратной транскриптазы; эта цепь в свою очередь используется в качестве матрицы для синтеза второй цепи. После Ферментативной обработки эту двухцспочечную комплсмснтарную ДНК встраивают в некгор. Независимо от того, какая именно стратегия клонирования используется, после илентификации клонированной последовательности необходимо показать, п.о она прелставляет собой нативный структурный ген. ЛИТЕРАТУРА Вегйег В. 1, А. К.
КЛпппе1 (ег!.). !987. МегйоВг и Епгуто)о8у, чо1. 152. Оное го Мо1еги!аг С)ои1и8 7есйпигиек Асаг)егп)с Ргснз, ! опг)оп, Оп(гег) Кшйдош. Оагйп О. Е. 1995. Е1есггорЬогейс шсгйодн, р. 53 — !09. 7и Л. А. О!ане) апг) М. Р. !)епгьс!гег (ег).), 1пггог(исг(ои го В(орйуггса1 Мегйог(ч Гог Ргоге(и апВ Мис!его АсЫ Вегеаггй. Асаг)еш)с 1'гснж Вап !7)сйо, Сайб Ог!па(еаг! Л., Р. М. Венпеп (ед.). 1988. МегйоЫг т М(сгоМо)о8у, чо1. 21, Р1агтЫ 7есйпо1о8у.
Асаг)еш)с Ргснз, (.опдоп, (/п)(ед К)п8догп. 1оапнон А. Р., С. Т. Агпеппуа, Л. Оагпен, Р. М. Кго)не!, Н. Япхнуа, С. СЬеп, М. А. Ва(нег, Р. Л. г!е Лопй. 1994. А псчч бас!спор!зайе-г!опчу чесгог Гог 1Ьс ргорайабоп о! 1аг8с Ьшпап ОХА Ггайпгепгк )уаг. Оепес 6: 84-.89 К!пг О.-Л., В.
'чч'. В(ггеп, Т. 8!грай, У. Мапс!во, С. Воуьеп, Н;1.. Капй, М. 1. Вгтоп, Н. ВЬ!гнув. 1996. Сопмгцсбоп апд сЬагасгепка1юп оу а 1шгпап Ьас1спа1 ап!Вс(а! сйгогпозошс ВЬгагу. Оепотгсх 34: 213 — 218. 1еопагг!о Е. О., Л. М. Бед)чу. ! 990. А не я чесгог гог с!оп)п8 !агйе ец!гагуог!с ОНУЧА зсйшегз1з )п ЕзсйепсЫа сой. Вю/! есйпо)о8у8: 84! —.844.
Магбп С., 1,. Вгеяп)с(г, К.-К. Лцо, Л. С. Ъ'оу!а, 1. Вгопн!е1п. 199!. 1шргочег) сЬсш!1пш!пезссп! О)ч)А зейпепс1п8, В!оуесйпиуиег11: 110--1!4. ОЫ К. %., В. В. Рптгоне, 1985. Рг1пс(р1ез оу' Оспе Маи1ри1аг1оп, Згг) сд. В)ас)гчче!1 Вс(сп!гйс РпЫ!саг!опн, ОхГогг(, Опйег) К!пр1ош. ВазпЬгоой Л., Е. Г. ГгйнсЬ, Т. Мап1а1!а. 1989.
Мо)еги)аг С!оп(юг а 1.аЬога(огу Мапиа1, 2пд сд. Со!д Врпп8 НагЬог 1аЬогагогу, СоЫ Врппй НагЬог, г!. г'. Технолошя рекомбинантных ДНК 79 В!!яй1ош 3. 1., К. Е'. !)гопк, Р. Р. С)гее. 1993. Сопятгнсбоп о1 Х с)опс 1гап1гз, р. 121 — 146. ?и В. К. О!1ск апд У. Е. Т1гошраоп (ед.) „Лгейоагх гп Р!апг Мо!еси1аг Вга!аег апВ Вгогес)гпо1аеу. СКС Ргеээ, Боса Ка1оп, Г1а. Боа1йегп Е. 1975.
Псгссбоп ог зрес(ггс зег1ггспсеа ашопа РМА 1Уакпгсп1в эерата1ед 1гу яс! е!ес- ггорйогеэЬ../. Моб Вгоб 9Рн 503 — 507. ЪУ1ппаскег Е.-1. 1987. Егопг Непее го С7опеги !пггаг?ггсггап га Пепе 7ес11па!аяу. 'ггСН, !Мети Уог!г, !4.~'.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Что такое энлонуклсазы рестрикции типа П и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДН К? 2. При обработке кольцевой лвухцспочечной плазмиды рСВ! 1 различными рестриктазами и их комбинациями получаются следующие фрагменты (размеры указаны в парах нуклеотидов): ЕсоК1 — 6,0; ВатН1 — 6,0; Нгпг11!!в 6,0; Нае)1 — 3„0; 2,0 и 1,0; ЕсаК! и Нае)1 — 2,0 и 1,0; ЕсаК1 и НтдП1 — 3,5 и 2,5; ЕсаК1 и ВатН1 — 4„5 и 1,5; ВапгН1 и Нгпг)111 — 5,0 и 1,0; ВатН1 и НаеП вЂ” 3,0; 1,5 и 0,5; Нгпг!И! и Нае11 — 3,0; 1„5; 1,0 и 0,5. Испоггьзуя эти лаг гные, постройтс рестрикционную карту рСЕ(.1.
3. Опишите применение плазмиды рВК322 в качестве вектора. Какими особенностями она обладает? 4. Опишите основные свойства системы клонирования рПС. 5. Обычно банк клонов создают лигированисм плазмидного вектора, подвергнутого исчерпывающему гидролизу с помощью ВатН1, с хромосомной ДНК, частично гилролизованной рестргиктазой ЕаиЗА1. а. Почему в этом эксперименте используется два разных фермента? б. Что такое частичный гндролиз и как ег.о проволят? в. Почему к нему часто прибегают для создания банков клонов? 6. Зачем рестрицированную нлазмидную ДНК перел лигированием часто обрабатывают щелочной фосфатазой? 7. Опишите способы введения рскомбинантных плазмид в грамотрицательную бактерию„например в Е со?г.
Химический синтез, определение нуклеотилной паследовательносги и амплнфикация ДНК 8! Рис. 5.!. Химический синтез олнгпнуклеогила. После л циклов образуется олнацелочечнмйфрагментДНК из л+ 1 нуклеотиаа. твердой фазе (растущая цепь ДНК фиксируется на твердом носителе), что позволяет проводить все реакции в олной емкости, легко отмывать после каждого агапа нснужныс реагенты и добавлгпь новыс в количестве, обеспечивающем возможно полное протекание реакции. Этапы многоступенчатого синтеза представлены на рис. 5.!. Первый нуклеозид (азотистое основание + сахар) фиксируют на инертном твердом носителе, обычно это пористые стеклянныс шарики с порами одинакового размера. 3'-гилроксильная группа первого нуклеозила, который булет 3'-концевым нуклеотидом синтезнруемой цепи, прикрепляется к спсйсерной молекуле, ковалентно связанной с носителем.
Чтобы прслотвратить неспецифическое взаимодействие 5'-гидроксильной группы первого нуклеотила до добавления в реакционную смесь второго нуклеотида, ее защищают с помощью диметокситритильной (ДМТ) группы (рис. 5.2). Такую группу содержит каждый присоединяемый к растущей цепи нуклеотнд, а кроме того, он несет диизопропиламинную группу, присоединенную к 3'-фосфнтной группе, которая в 82 ГЛАВА 5 ДМ: — О ! СНг ;Х<à — О ! Первое СНг основание Основание Первый нуклеознд Нткаеозил О Н ! Р н сн ~с,х .-О н и сн, С сн сн О Н ! Метилированиаа 3'-фосфитна группа диизо- пропил- аминнаа группа Спейсер Стеклянный шарик С=О ! <сн ) ! С=О ! (чн (Снг)а ! <чН ! С=О ! О ! (СН ) ! О (СНг) з ! 5< Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
