Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 24
Текст из файла (страница 24)
иб 3) термостабильнал ДНК-полимераза, которая не теряет своей активности при тслгпературе 95* и выше; 4) четыре дезоксирибонуклеотида. Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следуклцих трех реак~ [ий. Рве. 5Л7. Секвенирование ДНК методом праймер-опосредованной про~улки. 1. Инициация синтеза цепи ДНК с помощью праймера (Р1), комплементарного участку плазмилы, находящемуся вблизи вставки. 2.
Секвепирование фрагмента клонированной ДНК длиной 250 — 350 нуклеотидов. 3. Полбор второго праймера, комплементарного концевому участку уже секвенировашюй последовательности длиной примерно 20 нуклеотидов. 4. Секаенирование следующего сегмента клонированной ДНК с помо~лью второго праймера (Р2). 5. Подбор третьего праймера, комплементарного концевому участку мого сегмента размером 20 нуклеотилов. 6. Третий праймер (РЗ) используется ллл секвенированил следующего сегмента кюннрованной ДНК. Эту нропслуру продолжают ло тех пор, пока не будет секвенирована всл вставка. !.
Денангу(ла(ия. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДН К выдсрживанисм его при температуре 95 С в течение по крайней мере ! мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза 7ад, выделенная из бактерий ХЬегтиз идиалсиз, и четыре дезоксирибонуклеотида. 2. Ренатураг(ин. Температуру смеси медленно понижают до -55 'С, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностлми ДНК.
3. Синтез. Температуру повышают до -75 С— величины, оптимальной длл ДНК-полимсразы Тад. Начинается синтез комплсментарной цепи ДНК, инициируемый 3 -гидроксильной группой праймера (рис. 5.18). Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически.
Кахдый цикл обычно длится 3 — 5 мин. Чтобы понкгть как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представлять положение всех ~ ~раймеров и комгщементарпых им послсдователь- Хггмггческий синтез, опрелеление нуклеотилной последовательности и амплификация ДНК 95 ПЕРВЫЙ РАУНД 2 Исходная ДНК ~райнеры Р! и Р2 Дена»трап Реиатурац ДНК-цехин«раза Рад д!чтР Исходная цепь Р2 Исходная пель Синтез «Длинная матрица» 2 Исходная цепь «Длинная матрица» т Исходная цепь Рис.
5. !8. Первый раунд П11Р. ДИК-мишень фланкирована последовательностями ! ' — 2 в одной цепи и последовательностями ! — 2' — в другой. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р! и Р2), ДНК-полимеразу Тае и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (61ЧТ Р). Смесь нагревают до 95 С, инкубируют в течение 1 мин и медленно охлаждают до 55 С. При этой температуре праймеры, добавленные в избытке, спариваются с разлеленными цегмми.
Повышают температуру до 75 "С. В этих условиях происходит синтез обеих цепей ДНК, начинающийся с 3'-гидроксильньгх концов праймеров. Каждая из синтезированных цепей имеет горазло большую длину. чем расстояние от 3 -гидроксильной группы «ее» праймера ло концевого нуклеотида последовательности„комплементарг!ой второму праймеру. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПИР. ностей в амплифицирусмых цепях в каждом раунде. В первом раунло каждая из новосиптезнрованных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3'-пщроксиг!ьной группы «ое» праймера до концевого нуклеотнда последовательности, комплементарной второму праймеру.
Такие цспи называют «длинными матрицами», именно на них будет и!гги дальнейший синтез (рис. 5. 18). 98 ГЛАВА 5 ВТОРОЙ РАУНД | Дома»грация Роиатурация 2 Р2 Синтез «Короткая ммрииа» Рис. 5.!9. Второй раунд ПЦР. Исходным материалом в этом случае является смесь молекул ДНК, образовавшихся а первом раунде (рис. 5.18). При отжиге ираймеры !ибридизуются с комплементарными им участками как исходных цепей, так и «длинных матриц», синтезированных в первом раунде. В результате»)!ермевтативиого синтеза !и И!го на исходных новях синтезиру!отея «длинные матрицы», а иа «длиннык матрицах» — «короткие».
Последние начинаются с одного праймера, а заканчиваются последовательностью, комплементарпой второму праймеру. «Короткая матрица» Во втором раунде двухцспочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной («длинная матрица») цепей, опять подвергают дснатурации, а затем отжигают с праймсрами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются «длинныс матрицы»„а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом («короткие матрицы») (рис. 5. !9).
Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются дснатурации и отжигу с праймсрами, а затем рсплицируются (рис. 5.20). В последующих раундах «коротких матриц» становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 1Оа раз превышает число исходных цепей нли «длинных» матриц (рис. 5.2!). Метод ПЦР получил широкое распространение. Разнообразные случаи его применения мы рассмотрим в последующих главах. Здесь упомянем лишь некоторые из них. Один из важнейших — идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений.
С появлением ПЦР отпала необходимость в выделении н очистке ДНК- мишени; для анализа можно использовать очень небольшое количество неочищенного материала. Для синтеза праймеров„специфичных в отношении исключителыю ДНК-мишени, нужно знать нуклеотидну!о последовательность ДНК предполагаемого патогенного микроорганизма. В этом случае в ходе ПЦР будет амплицицироваться только фрагмент ДНК, ллгша которого равна суммарной длине двух праймсров и фрагмента ДНК между ними. ПЦР— высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей 'ГРВГНй РАУНД Рис.
5.20. Третин раугцг ПЦР. При отжиге праймеры тибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также «длинных» и «коротких» матриц. При ферментатианом синтезе 1п уйто на исходных цепях синтезируются «длинные» матрицы», а на «тгяинных» и «коротких» матрицах — только «короткие матрицык | Ленятуряция Ренятурация т Р2 ТРИЛЦАТЫ й РАУНЙ Дяиатуряция | Ряиатурацяя Р2 Г Р1 Синтез Рис. 5.21.
Тридцаты и раунд П ЦР. На этом этапе я ре- акционной смеси содержатся практически одни «ко- роткие матрицыж из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположптельныс результаты. Это заставляет пцательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.
Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесепил специфических мутаций ит уйго, сборки полноразмерных генов из синтетических олигопуклсотидов, секвспирования ДН К. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продукта. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по- 7- 5185 Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК ч7 98 ГЛАВА 5 леотид оказывается достаточно для спаривания молекул и их последующего лизирования.
Лолучение е помои(ыо Л((Р кх(НК, оглвечаюи(их концам молекул лгРНК С помощью ПЦР можно получать комплементарные ДНК (кДНК), отвечающие 3 — или 5'- концевым участкам специфических информационных РНК (мРНК). Для обозначения этого метода используется сокращение 1(АСŠ— от англ. гарЫ атр14саг(оп оУсдЛ(4 епг» (быстрая мЕЦКС | Прнспвлннпннв пйвймсрв и!(вп(дт) ААААЛААААААААААА мр(!КО ! Синтез первей цепи„ прнспеляненпе првймврв | Синтез второй цвпн; нвскппькп рвузгппв вмппнфнквцнн т(ХхТП (т " Р | Ппспепующпе раунды амплнфнквцнн ГГЦР-прплукт ЛЛЛЛ ААААА — ~ Р скольку полимераза Та(( присоединяет к 3'-концу синтезируемой цепи лишний адениннуклеотид„что снижает эффективность лигирования. Но сели вектор для клонирования обработать рестрицирующсй нуклсазой с образованием новых тупых концов и затем проинкубировать с полимсразой !ад в присутствии бТТР, то к обоим 3'-концам фрагментов добавится по одному тимидинпуклеотиду.
Взаимной комплементарности концевых участков вектора и ПЦР-продукта протяженностью в один-единственный нук- Рне. 5.22. ППР-амплнфнкация кДНК, комплемензарной 3'-концсвой части мРНК. Первая цепь кДНК образуется в результате обратной транскрипции мРНК при участии о1!яо(033 в квчесгве праймера Вторая цепь сннтезнруетея нв первой цепи как на матрице с помощью полнмервзы Таа н генспецнфичного праймера (СВР1). В последующих раунлах ПЦР нсппльзуюгея праймеры СВР2 н Р. Химический синтез, определение нуклеотидпой последовательности и амплификация ДНК 99 амплификация концов кДНК).
Обозначения 3' ВАСЕ и 5' КАСЕ относятся к амплификацни кДНК, отвечающих соответствующим концам м)'НК. В обоих случаях для проведения П ЦР- амплифнкации нужно знать нуклсотидную последовательность кодируюшей области мРНК- мишени, чтобы синтезировать генспецифичный праймср (ОВР). В случае 3 ВАСЕ праймсром л!РНКП Присоединение лзрайллера ПВР1 мРНКС -| ПДР! ~ Синтез первои цепи; присоединение ро1у(Л)-хвоота 3' АААААААААЛЛЛЛ Присоединение преьмера о!!Во(дт) | Синтез второй цепи; неекопько раундов амплифихации Сла!'!' Р Т'ПТ'П П'ТТ Слзр)' )"тхет~'".'," в ~ — АЛЛАЛЛЛЛЛ ПЦР-продукт Р Д вЂ” ЛАЛЛЛАЛААА Рис.
523. ПЦР-амплификация кДНК, комплементарной 5'-концевой части м РНК первой цепи, осуществляемая обратной транскриптазой, инициируется праймером ОлЗР. Затем к этой цепи с помощью концевой лезоксинуклеотилилтрансферазы присослиняетси ро1у(А)-хвост. Двя си!нева второй пепи в качестве праймера используеюя о))во(е)Т).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
