Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Влияние глюкозы, лактозы и сАМР на транскри!щию, регулируему>о 1аг-нромотором Е. со!с Стрелка указывает направление транскрипции. (По данным работы АЬС1еь е! а1., 1992, Вгоеггетгзггу, р. 383, Запел апг) Ване!! Рцы(ьйегь, Ванов, Мазь.) Регулируемые 5!ромолгоры Наиболее н>ирако иснользук>тся следующие сильные регулируемые пролюторы: прамоторы (ас- и йр-операпов Е. са15; специально сконструированный гас-промотор, включающий — 10-область (г>с-Орох!отара и — 35-область йр-промотора (уп>г>стки, находящиеся на расстоянии !0 и 35 п. и. до сайта инициации транскрипщси); левый, или рг, промотор бактериофага ).; промотар гена 10 бакгериофага Т7. С каждым из них связь>ваются соответствующие репрессары, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специФических генов. Кроме та- га каждый из этих праматоров узнается холоферментом РНК-полимеразай Е ст>(5, в который входит основной сигма-фактар, присутствующий в клетке в значительно больших количествах, чем другие, минорные сигма-факторы.
Благодаря этому транскрипция не останавливается по причине недостатка свободных сигма- факторов. В отсутствие лактазы в среде (сгс-Орал!с>тар Е. СОВ находится в репрессированном состоянии, т. е. он выключен бслком-репрессорам, блокирующим транскрипцию гас-опер!>на. Индукция, или включение 1ас-оперона происходит при добавлении в среду лакп>зы или изопрапил-1)-(3-тиагалактоииранозида (ИПТГ). Оба этих сОсдинсни5! ИрсдОтвращают связыванис репрессара с (аг-опсраторол>, и транскрипция возобновляется.
Транскрипция, ка>ггролируемая (ас.-г>ромотором, регулируется также с полнлпью белка— активатора катабализма (СЛР) (рис. б.2). При связывании СЛР с прахи>тором повышается сродство последнего к РНК-полимеразе, н усиливается транскрипция примыкающих к нему генов. В свою очередь сродство СЛР к промотору повышается при его связывании с цикличс- Нгх ГЛАВА б ским АМР (сАМР), уровень которого гювыгиается при снижении концентрапии глюкозьг в среде. Таким образом, если репрессор не связан с опсрпором, то в присутствии игщуктора при повышении внутриклеточной концентрации сАМ Р может произойти усиление транскрипции гег юв„регулируемых загс-промотором. Г!а самом деле в плазмидных экспрессирующих векторах используется олин из вариантов (ас-промотора — (аг((Г5 с ггзлгененногг — 1О-последователыюстью„более сильный, чем (ас-промотор дикого типа.
Транскригщия с ггромотора (ас также подавляется !ас-репрессором и возобновляется при добавлении в срелу лактозы или ИПТ1 . Промотор гг(г выключается под действием комплекса триптофан — ггр-репрессор, который связывается с Нр-оператором и предотврагцает транскрипцию йр-оперона. Активация (включение) пр-промотора происходит либо при улалении из среды триптофана, либо ггри добавлении 3-ипдолилакриловой кислоты.
Работа промотора р" регулируется репрессорпым белком с! бактериофага 7.. На самом деле для регуляггии транскрипции с р'-промотора обычно используется терьючувствительная мугантная форма репрессора с1 — белок с1,.„. Клетки, синтезирующие этот репрессор, сначала выращивают при температуре 28-30 "С; в этих условиях репрессор блокирует транскрипцию с дь-промотора. Когда культура достигает нужной фазы (как ггравпло, середины!о8-фазы), температуру повышагот до 42 'С. при которой с1 „-репрессор инактивируется и навгнается гранскрипция. Для транскрипции с промотора бактериофага Т7 нужна соответствуюпшя РНК-полгглгераза.
Чтобы можно было исггользовать этот промотор, ген 1'НК-полимеразы фага Т7 встраивают в хромосому Е. со((в составе профага )., поместив его пол контроль (ас-промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой„содержащей генмишеиь под контролем Т7-пролил ора, и добавлякп в среду И ПТГ. В этих условиях происхолгп индукции гена РНК-полимеразы Т7, синтезируется РНК-полимераза и происходят транскрипция и трансляция клопироваггного гена.
Часто между временем инлукпии гена РНК- полимеразы Т7 и началом транскрипции гена- мишени проходит более часа. Для гранскрггпции с сильного 'Г7-пролютора создана целая серия плазмид, получивших название рЕТ-векторов. Эффективность инактивации белка-репрессора и соответственно актива Нггг транскрипции зависит от соотношения между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Если концентрация репрессора слишком велика, то транскригщия не инициируется, и наоборот, если молекул рспрессора очень мало (даже при том, что их больше, чем копий промотора), то транскрипция может идти и в отсу~стане индукции. Про такие промоторы говорят, что они «текутзь Чтобы осуществлять строгий контроль таких регулируемых систем, разработаны разные стратегии.
Например, ген репрессора и соответствующий промотор гюмешают в д разные плазмиды, присутствующие в клетке в разном числе копий; это позволяет г юддерживать нужное соотношение между числом молекул репрессора и числом копий ггромотора. Обычно ген репрессора находится в малокопийной плазмиде, число ее копий в клетке не превышает 8, а промотор — в мультикопийной плазмиде с 30 — !00 копиями на клетку.
Ген репрессора может бьгп локализован и в хромосомной ДНК, нахопясь вней в единственном числе, что позволяет подлерживать низкую концентрацию реггрессора. В системах, использующих (ас-промотор, можно получить (ас-рспрессор в значительно большем количестве, если заменить (ос1-ген его мутантной формой (ос1г, что приводиз к уменьшению «протекания» промотора, т. е. к снижению уровня транскрипции клонированного гена без индуктора.
Получение больших количесогв белковых продуктов Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинангных штаммов Е. со(1 была сконструирована плазмида рРЕс2833. Она содержит сильный промотор, селективггый маркернгяй ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами лля рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно ш промотором. Эффективность этою экспрессиругошего вектора в осупгествлении синтеза чужеролных белков в Е.
сой можно еще Оптимизация экспрессии !снов, клонированных в прокарнотнчсских системах 109 Паомптор дь Чпсяп копай Оя клетку 23 "С 24 'С Пяазмяда 521 42 7!3 рк(4402 РР!.с2ХЗЗ рСРЗ Х2 ЗХ 60 ЯПОЯОННЫО ГОЕОГЫ Яеыаи! е! Ы., 19ХЗ, бело 22: 103 — 113 а Нас Нае1! ед Г!лзреояпяе ЗНДОНУКЯЕОЗОЯ Плеи и еп | разрезание зндонухясазой и!еп Выяеясняс фра!ион!ОО ! а 3 Выделение фрагие!пас яеп аей )абдича 6. Е Зависимость числа копий трех плазмид- ных зкспрессирукзщих векторов от еыпературы!! больше повысить, заменив саит инициации репликапии плазмиды рР!х2833 аналогичным сайтом плазмиды рК)л(402.
Это приводит к увеличени10 чисча кОпий мОдифицирОваннОЙ плазмиды в 5 — !О раз при тел!пературе 42 "С (табл. 6. !). Полученная таким образом плазл!ида рСРЗ содержит р'-промотор и ген (3-пакт амазы (! ен устойчивости к ампиниллину) из рр(.с2833, а сайт инициации репликацни — из рК(л(402 (рис.
6.3). Несущие ее клетки сначала выращи вают при тем перси уре 28 "С, Рис. 6.3. Создание плазмиды рСРЗ. Нз ллазмиды рК(9402 с помолдьк! рсстрини!Идонукяеазь! )тпе(! вырезах!т Фрагмент с, содержащий темпсратурочувствительный саит инипиании репликапин (ог!)„и сшивают его с Нас! 1-Фрагментами 1 и 3 плазмиды рр1с2833. Фрагмент ! содержит рь-промотор и пояплянкер (ПЛ), а Фрагмент 3 — селективный маркерный ген устончиассти х ал1- пипияя ипу (Ашр'). а затем — при 42 'С. При пониженной температуре ген с!-репрессора, инте1рированный в ДНК Е.
со!!', экспресснруется, р'-промотор не функционирует и образуется обычное число копий плазмиды (табл. 6.!). При гювышении температуры с1-репресор инактивнруется, рь-проллотор переходит в активное состояние,, и числа копий плазмиды увеличивается. Все это и делает плазмиду РСРЗ эффективным экспрсссирующим вектором. Когда ген ДНК-лигазы Т4 был встроен в полил!ликер РСРЗ, то выход его продукта составил примерно 20% от общего количества белка, синтезируемого Е. ссЖ при 42 'С.
Прн этом на дол!о собственнь1х, наибот!ее активно сннтезируемых белков Е. сой, например фактора элонгапнн ЕГ1п, прихолится примерно 2%. Крупномасштабные системы При культивировании в небольших объемах (от ! до 5 л) индукг!ию экспрессии осуществляют либо измснеписл! температуры, либо добавлени- Пб ГЛЛВЛ6 Белок, кодируемый клоиироккииыы геном, ие синтезируется (репрессия) (Лерепрессия) л вр Белок, кояируемый ю1оиировкиныл1 геном, оиитезируегся (лерепрессии) ем химического индуктора. Однако в опытных установках (20 — !00 л) и в ~~ромышлепных биореакторах (>200 л) температуру нельзя изменить мгновенно, для этого требуется время от 30 ло 60 мип; кроме того, па подъем температуры нужна э~ ~оргия.
И время, и энергия стоят дорого. Столь же дорого обходится и применение химического индуктора, например ИПТГ. Все это может сделать процесс неэкономичным. Для преодоления некоторых проблем, связанных с использованием рь-промотора Лля крупномасштабного производства белковых продуктов, была разработана лвухплазмплная система. Ген репрессора с! поместили под контроль Пр-промотора и включили в малокопийпук> плазмиду (рис.
6.4), что обеспечило невысокий уровень синтеза репрессора. Вторая плазмила содерхац1а клонированный ген, нахопяшийся пол контро- А. Без лйиитофаик Белок с( синтезируется Б. С триитофаиом 1! Белок с( ие сиизезируется | (репрессия) лир лем рь-промгпора. Как видно из рис. 6.4, А, в отсутствие триптофана включается яр-промотор и синтезируется репрессор с), выключающий р'-промотор.
И наоборот, как видно из рис. 6 4, б, при наличии триптофана Пр-промотор выключается, репрессор не синтезируется, а рь-промотор активно работает. Культуры с такими лвухплазмилными системами можно выращивать на недорогих средах на основе гидролнзатов мелассы или казеина, содержащих незначительное количество свободного триптофана, и индуцировжь экспресси1о клонированного гена цобавлением в срелу триптона. Последнии содержит шюбодный триптофан в количестве, достаточном лля эффективной индукции транскрипции. Пробные испытания этги) системы показали, что на долю пролуктои клапированных генов ))-лактамазы и цитратсин- Рис.
6.4. Дв>хплазмилная система, позаоляк>шая контролировать работу р'-промотора Фага )л цугом регуляции синтеза с!-репрессора с помощью тринтофана. Ген репрессора с! вместе с триптофаиовым промотором (р яр) пахолятся а одной плазмиле, а рь-промотор и клопировапный ~си — в другой. Стрелками указано направление транскрипции. А. В отсугствие.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
