Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Процедура состоит в следующем. Подбирают два праймсра, гибридизу>ощиеся с участками ДНК, которые фланкируют искомую последовательность. Денатурируют ДНК, отжигают одноцепочсчныс молекулы с праймсрал>и, добавленными в избытке, и осуществляют синтез ДНК и> т!1гг>. Ддя облегчения синтеза используют термостабильнун> ДНК-полнмеразу, которая нс разрушается при температуре денатурации (95 С). Затем опять проводят дснатурацию, отжиг с праймерами и синтез, и т.
д. до примерно 30-го раунда. К этому времени в реакционной смеси преобладают фрагл>сить>, на одном конце которых находится одна праймерная последовательность, а на другом -- последовательность, комплемснтарная второму праймеру. Г!ЦР можно использовать для выявления патогенных микроорганизмов в том или ином биологическом материале; получения больших количеств специфических фрагментов ДНК с целью клонирования; амплификации 5'- и 3 -концов специфических мРНК; синтеза генов; выявления делений или вставок в генах, ответственных за то или инес наследственное заболевание.
ЛИТЕРАТУРА СЬеп Е. 1'., Р. Н. Яеейпгя. 1985. Бг>регсо!! всцнспс!пя: а Гам апд яшр1с тс1Ьог) Гог асг)испей>я р1аып>В О)л(А. )7)>А 4: 165 — ! 70. Сйпие В., О. 3>. Яап(1. 1990. СЬепцса! вупгйеыв оГ >Ьс 1ЬугпЫу!агс аупгйазс денс. Ргос. >>>а>6 Асаа'. 5сй Г>5А 87: 633-637. О1 Оопа1о А., М. де !л(!пПя, Ь!.
Кпяяо, Я. О! В1аяс, О. О'А!езз!о. ! 993. >>> п>сгйог( йп зупгйеа!апя яснев апг! сГ)>чАз Ьу 1Ье ро!угпегаве сЬат геасВоп. Апай В>ас)>ет. 212: 291 — 293. Ег11сй Н. А., О. Ое!Гапй, 3. 3. Япшаку. ! 991. Кссспг агцапсев >и 1Ье ро1ушегаве сйа>п гсасг>оп. 5с>енсе 252: 1643 — 1651. 104 ГЛАВА 5 Рох ГГ. К., В. %еа((а!1, М. !с(а(Ьап, А. Л. НпйЬев, Лг., А. Казй(с)йап, 1). М. Ясйсса1ег. 1996. 51г!с)!пй псч сйзсапсез сг!1Ь 5 КАСЕ: 1опй 5'КАСЕ оГ Ьцгпап АРС апс) ТВС-2 сВ)с(А. Расие 18: 33 — 37. На1спга К., Л. Л. Коав1, К. В.
%айасе. 1984. Вуп1Ьсгйа апс1 пае оГ аупбйейс о1!Вопус1еосЫез. Аппп. гсек В(ос(сет. 53: 323 — 356. Мп)!!в К. В., К Регг6, К. А. С!ЬЬа (ей.). 1994. ?йе Ра(угиегаае Сйа!п Рсеасс(ои. В!гЬЬассзег, Воз!оп, Маза Ба!Ь! К. К., Р. Н. Се!(апй, Я. $1оГГе1, Я. Яс!сагГ, К. Н!8всЬ1, С. Т. Ногп, К. В.
Мп1188 Н. А. Егйсй. 1988. Рг!снег-с)!гессес! епаутайс агпрййсасюп оГ Г)14А с«ИЬ а СЬеггпозсаЬ!е В!ЧА ро!ущегазс. Лс(епсе 239: 487 — 491. Бапйег Р., Я. !Ч!сИеп, А. К. Сов(аоп. 1977. с)ХА зсццепсспй сг!1!з сЬа!и-Сепп(пайпй !стЬ!Ьйсогв. Ргас.?«'аг!.
Асас(. Бсб ((5А 74с 5463-5467. Ясйыа1ег 1). М., С. %. Ввс)впал, А. Кавй(сй!ав. 1992. А гйпзр1е астс! еГГсс!епс пзсгЬос) Гог атрййсагюп оГ сР)чА спс)з цгйпй 5'КАСЕ. Расиг 14: 46-52. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Предположим, что васп новый ДНК-синтезатор имеет среднюю эффективность присоединения цуклсотилов 98,5%.
Каким булет выход продукта, если вы синтезируете гибрилизацион ный зонд длиной 50 нуклсотидов? 2. Какие две стратегии химического синтеза гена длиной 0,5 т. п. н. вы можете предложить? Какую из них вы предпочтете? 3. Что такое линкер? Где его используют? 4. Что такое дидезоксинуклеотилы'? Как с их помощью определяют нуклеотидную последовательность ДН К? 5. Почему можно определил, нуклеотидную последовательность только олноцепочсчной ДНК? 6.
Как определяют нуклсотидную последовательность клонировапной ДНК с помощью векторной системы на основе фага М1 3? 7. На месте преступления обнаружен олин-единственный волос предполагаемого преступника. В нем содержится 10 — 20 пикограмм (! 0 и г) ДНК. Чтобы охарактеризовать столь малое количество ДН К и определить, идентична ли ее нуклеотидная последовательность таковой у ДНК подозреваемого, нужно !Π— !00 нанограм (!О ~ г) ДНК. Как получить ес? Какую информацию вам нужно собрать, прежле чем предприниматыаскис-то действия? 8.
Что такое «длинная матрица», «короткая матрица», как меняется соотношение межлу ними с увеличением числа ПЦР-раундов? 9. Как синтезируют гены с помощью ПЦР? 10. Как «превратить» концы молекулы мРНК в кДН К? ГЛАВА 6 Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах Основная пель экс~ ~сри ментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — полбор условий для эффективнои экспрессии В нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор ешс не означает, что этот ген будет экспрессирован.
В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданныьь уровень его синтеза должен быть достаточно гиясокнм. Для достижения эффективной экспрессии уже сконсгруировано много специфических векторов; д:и этого проводились манипуляции с целым рядом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболсс важны следующие: ! ) тип промотора и терминатора транскршшии; 2) прочность связывания мРНК с рибосомой; 3) число копий клонированного гена и сю локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки); 4) конечная локализация синтезируемого продукта; 5) эффективность трансляции в организме хозяина; б) стабильность продукта в хозяйской клетке.
Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. Большинство таких генов имеют уникальные люлекулярные свойства, и оптимальные системы экспрессии лля каждого из них приходится подбиржп всякий раз заново. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена зависит также от его )юдства с организмом-хозяином. Несмотря на то что многие представители как про- так эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отнсниении продуктов с помон)ью технологии рекомбинантныхДНК используют в основном ЕюсЬег(сага сон.
Зто связано прежде всего с тем, что генетические, молекулярно-биоло~ ические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме тот<к это наиболее дешевыи и быстрыи способ получения многих белков. Но для экспрессии некоторых клонированных генов используются и другие организмы-хозяева: В. зиИИ(з, дрожжи, животные, растения и т. д., хотя стратегии, разработанныс для Е соИ-систем, в принципе ~~рг1мених1ы и в этих случаях.
Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемою промотора, расположенною перед данным генохь Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) трацскрибируются.
Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного !ас (лактозного)-оперона Е со6. Однако есть и другие промоторы, облалающие полезными лля контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перел так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным !06 1ЛАВА 6 рованного гена является встраивание его в плазмиду так, чтобы он находился !юд контролем постоянно функ!Шонирук>щего сильного промотора.
Однако непрерывная экспрессия чужеродного гена люжет оказаться гибельной для клетки-хозяина, поскольку приводит к истощению ее энергетических ресурсов н нарушению метаболизма. Кроме того, плазлзиды, несущие постоянно (конститутивно) экспрессирующийся ген,нередко утрачивакзтся после нескольких клеточных цикюв, поскольку не содержащие их клетки растут быщрее и со временем становятся осомввв дНК АЬс1 егюр~ ер Разрезание знаонуклсазоя АЬс1 Аьс1 АЬс! Аьс1 АЬс! Аьс1 АЬс! Аьс! Аьс! 1!везл Разрезание знвонуллевзов АЬс! Аьс! АЬс1 АЬс! Ген-репортер промотора, встраивают случайные фрагменты ДИК (рис.
6.1). Если в результате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то делают вывод, что клонированный фрагмент содержит функпиональный промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продув!ы, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который идентифицируется с помощью доськгочно простого колориметрического теста. Можст показатьслз, что наиболее подход51- щим способом оптимизации экспрессии ктони- Рис. 6.1. Идентификаггиг! сильных регулируемых промоторов. В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хрол!осело ную ДНК разрезают рестрицирующей эндонуклеазой АЬс! и встраивают фрагменты в плазмиду. Если ген-репортер эффективно экспрессируетсв, значит, клоннрованный фрагмент солержит функциональный промотор. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокяриотических системах 107 в культуре нреабладак>шими.
Нестабильность плазмид -- этО ОСНОвна5! п(заб>>сна, мсша>аща5! получению продукта ге>ш, локализованного в нлазмиде, в промышленных масштабах. Дл>! ее решения нужно научиться контролировать экспрессию таким образом, чтобы клонированный ген экспресснравался только в определеннои фазе клеточного цикла и только в течение определанного врез>ени, а для этого нужно использовать сильные ре>улируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, назьгваются экспрессирующими вектарамн. Область )аг-пеомогоря/оперятора Копцепгряппя Копцентрацяя Копцепгрггция глюкозы лзятозы САМИ Уровень П>я>гекриггцяп Нязкий Низкая Низкая Высокая Низкая Низкий Низкая Высокая Высокая Высокая Низкий САМИ Высокий Низкая Высокая Высокая Рис. б.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
