Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Образующийся в результате химерный белок и будет служить анти- геном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирую!цем белке. и тогда останутся только антитела, связывакцпиеся с нужной аминокислотной последовательностью.
Олин из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5'-концевой сегмент гена отрр Е. со1!', кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающу!о к нему часть гена 1асУ. ())-галактозидазы) Е. со!1 (рис.
6.7). Этот сегл!ент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген 1асд. лишен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой форме р-галактозидаза с!юсобна функционировать независимо ог того, какие нептиды присоединены к ее )х-концу.
Геп 1асУ встроен в вектор таким образом, что он попадает «не в ногу» с рамкой считывания лидерной последовательности атрЕ, поэтому активная ))-галактозидаза не образуется. Однако если рамка считывания какого-либо клонировапного фрагмента ДН К согласуется с таковой для генов перри 1.асУ., то образуется трехкомпопептный химерный белок, состоящий из ОшрГ-фрагмента, белка, кодиру- Рис. 6.7. Клонврующнй еекзор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к амцицнллину (Ащр') в качестве селективного маркера, 5'-копцевой сегмент сена атрГ, кодирующий )Ч-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрнцирующей эндоцуклеазы АЬс! и укороченный ген )3-галактозугдазы ()асУ). Ген, который хотят ю!онировать, встраивают в АЬс1- сайп.
После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуеуся трехкомпопентный химерный белок. 114 ГЛАВА 6 Таблица б.З. Очистка хилгерных белков, пролуцируемых Е. са11О Условия злюировяиия Компонент химерного белка, Размер Аятитело связьпиюпкйюя с яитвтеломтг Хо Гиспозиновьгй «хвост 5!сер-1ва Р1пРо~пз МВР (3-Лвктвл~нзв СИТ Нвй 14 клв б — 1О ел~инокислот 10 аминокислот 13 кДв 40 кцв 27 кдв 25 кДв 8 вмипокислот Низкий рН Имиллзол Илгинобиотин 18О Бйэ« Стрсптввилин Стрсптнвилин Амииозв Биотин Мвлмозв Борт Восетвггюп~икзеюглий реагент ! !иэквя коппентрлния кальция Феннлборет Глуглтион Снегу«~фингалов люноклонвльиое внтитело '1 пол«иным мбозы теувюн ее е1, 1994, гг«саг лллссйлс!.
12: 384 — 188. э' ях — фрагмент белка А ясрйууы сссю аигсю; Гиюр г«8 — пепгнл, облеллююнй срслс сом к сноп««енэюну; Рюгоюг -. белковый фрегмент. био гнннлнровенный в Е сей 1п гно; МВР— мельтоэссвяэыееюший белок: Сбт — глугстнон бтрл~ кфсрюс; Нав — пспэнл, уэнлюсмый эн гсрокянеюй. емого клонироващ1ым геном, и функционально активной С-концевой части р-галактозидазы. Он может использоваться как антигсн для выработки антител, дающих перекрестную реакпию с белком клонированного гена, или как инструмент для получения небольших фрагментов специфических белков.
Химерные белки используются це только для стабилизации полипептидов, но и для упрощения процедуры очистки рекомбинантных белков (табл. 6.3). Так, плазмидная конструкция Басс(гага111угеу сегербу(ае, содержащая ген человеческого иптерлейкипа-2 с присоединелшым к нему сегмегпом ДИК, кодирующилг маркерный г1ептид Ахр-Туг-Ьуз-Азр-Ахр-Азр-Лбр-1 уб (он продается под назваушем Г!аб), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацито продукта ге!и интерлейкина-2 и облегчает его очистку.
Интерлейкин-2 — это биологический фактор, стимулиру1ощий рост Т-клсток и синтез В-клеточньзх антител. Химерный белок, образующийся после экспрессии этой генетической конструкции в дрожжевых клетках, может быть очи!цен за один прием с помощью иммуноаффищюи хроматографии. Для этого моноклональпые азгпггела к маркерному пептиду фиксируют на полицропиленовом носителе и пропускакэт через колонку химерный белок, который связывается с этими антителами (рис. 6.8). (Ыаркерный пептид — небольшая молекула, на его образование расхолуется лишь малая часть клеточных ре- сурсов.
Химерный белок облвдает такой же биологической активностьку, что и нативный интер- лейкин-2. Однако если он предназначен для примсне11ия в клинике, то маркерный пептид необходимо удалить. Таковы требования государственных служб, контролирующих использование фармацевтических препаратов. Для этого можно использовать бычью энтерокиназу. Мзюгие белки, продуцируемые Е. са11, накапливаются в клетках в форме нерастворимых биологически неактивных телец включения. И хотя из таких структур часто удается получать в небольших количествах биологически активный белок, для этого приходится проводить продолжительную солюбнлизацию.
Плохая растворимость белков ш угро часто обусловливается их неправильной укладкой, и эту проблему пытались решить различными способами. Так, известно„что химерные белки, одним из компонентов которых является тиоредоксин, белок мол. массой 11,7 кДА, остаются в растворе, даже если на их долю приходится 40% суммарного клеточного белка. Имея это в виду, ген-мишень встроили в полилинкер сразу вслед за геном тиоредоксина, так чтобы оба этих гена попали под контроль р"-промотора в плазмидном векторе Е. са11 (рис.
6.9). В хромосоме хозяйских клеток Е. га11, использующихся в этой системс, присутствует генетическая конструк1 1ия, детерминирующая образование репрессори г! — копия гена с1„находящаяся цод транскриппионным контро- Оптимизация экспрессии генон, клонироваиных в прокариогических сис!омах 115 Рис. 6.8. Очис !ка химерно! о белка с помощью иммуноаффииной хроматографии. Антитела к маркериому иеитилу химерного белка фиксируют па з.всрлом носителе и пропуска!от через колонку химерный белок.
Маркерный пептид, вхоллший в состав химерного белка, связывается с аитителами, а ясс остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки. !. Смесь секретяроваиных белков Иитерлейкия-2 о~ Маркерный иеитил ~ '6!. 2. Полготовка колонки ляя имыуиоаффиииой хрома! гя рафаи лем промотора Пр. В отсутствие триптофана (рис. 6.9, А) репрессор образуется в количестве„ достаточном для блокиронаиия транскрипции с р!.-промотора, и химерный белок не синтезируется. Когда в среду добаюиют триптофан (рис. 6.9, Б), угр-промотор выключается и белок-репрессор не синтезируется, а гены химерного белка транскрибируются с плазмидного р'--промотора. Оинтезируемый химерный белок, состояп(ий из тноредоксина и белка-мишени, концентрируется в основном в особых областях с внутренней с гороны илазматической мембраны Е.
со!!, называемых зонами адгезии, и высвобождается из клеток при осмотическом шоке. Далее белок-мишень можно отшепить от химерного белка с помощью энтерокиназы. Химерный белок, содержащий тиоредоксин, можно очистить еще одним способом. Если белок-мишень остается стабильным ири повышении температуры, то, поскольку тиоредоксин не разрушается при нагревании вплоть до 80 О, химерный белок можно инкубиронать при нысоких температурах и освоболиться от больишнства других клеточных белков, разрушающихся прн этих условиях.
Полиироиялеиовая иелльжка Антитела к маркерииыу иеизилу 3. Наслаивание смеси белков Маркерный пел~ ил, каийся изелом Все сстальиые О д ~ь белки Включение белков в поверхностные структуры Для скрининга обширных (ло 5.10ю клонон) библиотек комилементарных ДНК (кДНК), колирующнх редко встречающиеся белки, были разработаны специальные системы слияния. Обычно кДНК встраивают н гены поверхностных белков (белков филаментов или пилей) нитчатых бактериофагов (напрнмер, М13) илп бактерий и после транскрипции и трансляции получают химерные белки, входящие в состав поверхностных структур этих микроорганизмов. Здесь их идентифицируют иммунологическими методами.
Часто для слияния используют ген поверхностного белка р1И фа!а М13, который снязынается с Е-пилями Е. сой и инициирует инфекцию. Для клонирования кДНК и других 4. Элюирояьяяе химерного белка ИИ6 ъХимерный белок М й к Маркерный не итиа ! 16 ГЛАВА 6 влияя нк Хямсрныа белок не синтезируется Плязмялная нк Библиотеки, содержащие гены поверхностных бактериальных белков, можно использовать и лля илептификации клонов, несущих специфические нуклеотилные последовательности. Чтобы включить искомый белок в поверхностные структуры грамотрицательной бактерии, например Е сой, спгивают его гены и гены белков этой структуры.
В качестве бактериальных белков используются белок наружной мембраны А (ОщрА) и пептилогликансвязанный липопротеин (РА1 ) Е. со)г', а также белок Е наружной мембраны Рзеиг)оглолаз аегъя(лоза (Оргр). При этом белок-мишень обычно находится либо на С-, либо на )Ч-конце химерного белка, но иногда короткие полипептиды включаются в середину молекулы бактериального белка (рис. 6.10) Химерный белок сянпезируелся копирующих последовательностей была сконструирована плазмида (фагмила)„содержащая неболыпой фрагмент ДНК М13, который обеспечивал ее упаковку щ у(гго в фаговые частицы. ~ ен белка рРН пол контролем какого-нибудь регулируемого бактериального промотора (например, )ас чзромотора Е сой) и сайт клонирования вблизи 5'-конца гена р1Н.
1!осле репликапии рскомбинаптного фага М13 в Е. сой белок-мигпень оказывался сшитым с )ч-концом фагового белка, и содержащие его бляшки можно было идентифицировать иммунологическими методами. Рекомбинантные фагмилы, выделенные из таких бляшек, могут служить источником соответствующей кДНК. Эта весьма эффективная селективная система позволяет обнаруживать кДНК редких, но очень важных белков.
Рис. Гь9. Экспрессия пдазмидного век тра с генетической консгрукцией »ген тиоредоксина — ген белка-ми~дени» я гпсутсзвис (А) и в присуюзвии (б) три птофана. С ц~елкя, помеченные рпя и р', указы. ааюз направление транскрипции. Сокращения и обозначения: опя — оператор„с которым связывается репргссор Ггр: о' — оператор, с которым связывается репрессор с1; рг" — гг промолор, р'— левый промотор бактериофага Х; ТТ вЂ” сигнал зерминацип з ранскрипции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
