Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 33
Текст из файла (страница 33)
е. несли вмесчо него ген-мишень, интегрированный в хромосомную ДНК. Для интеграции других копий гена-мишени в хромосомную ДНК хозяйской клетки повторяли эту процедуру, используя другие несущественные области ДНК. Повышение эффективности секреции Стабильность белков, кодирусмых клоннрованными генами, зависит от их клето шой локализации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабильным, если он секретирустся (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматнческой и наружной мембранами)„а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очисти и .
Обычно транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают И-концевые аминокислотные последовательности, называемые сигнальными пептндамн (сигнальными последовательностями, лидерными пептидами). Иногда удается сделать белок секретнруемым, присоединив к кодирующему его гену нуклеотидную последоватсльцостгн ответственную за сшпез сигнального пентида. Однако простое наличие сигнального нептида не обеспечивает эффективной секреции.
Кроме того, Е. соб и друтие грамотрицателы~ые микроорганизмы обы шо не могут секрстировать белки в окружающую среду из-за наличия наружной мембраны. Есть по крайней мере два способа решения этой проблемы. Первый — использование грамноложительных цро- или эукарпот, лишенных наружной мембраны, второй — создание грамотрш1ательных бактерий, способных секретировать белки в среду, с помощью генной инженерии. Если слияние гена-мишени с Фрагментом ДНК, кодирующим сигнальныи пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы.
Один из таких приемов, с успехом примененных в опюшении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х,. Когда такой химерный ген включили в плазм1идный вектор и использовали его для трансформации Е. сей, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х,, получили функциональный интерлейкин-2. По данным одной из работ, секреция многих ~ етерологич~ пях белков в Е.
сов зависит от уровня экспрессии соответствующих генов. Чужеродные белки, си1пезируемые наиболее активно, не обязательно столь же активно секретируются. Иногда интенсив~ ~ый си~ ~тез чужеродно г о белка вызывиет перегрузку секреторного аппарата и сто блокирование. Таким образом, если нужно, чтобы данный белок непременно секрегировался, то можно нопьгщться пошлзи п урове~ ~ь экспрессия соответствующих генов.
Некоторые грамотрицательные бактерии секретируют в среду белок, называемый бактериопином. Оц активирует фосфолиназу А, локализованную во внутренней мембране бактериалыюй клетки„в результате чего и внутрешшя, и наружная мембраны становятся пронипаемыми, и некоторые цито- и псриплазматические белки высвобождаются в кулыуральную срсду. Таким образом, можно встроить ген бактериопина в цлазмиду так, чтобы он находился ~ юд контролем сильного регулируемого промотора, трансформировать клетки Е сой этой плазмидой и слелать их нронццаемыми. Если же Е.
сов уже несут гец бактсрио~1ица, их можно трансформировать друз ой плазмидой, которая содержит ген нужного белка, сшитый с нуклеотидцой последовательцостью, кодируюцгей сипшлыпзй пептид. Если оба гена находю.ся под коапп.ролем однгяо промотора, то их мож1 ю индуцировать од~ ~овре- Оптимизация экспрессии ~ ецов, клоиировацимл в црокариозичесхих системах (27 менно, и белок клонированпого гена будет секретироваться в среду. Когда секретируемые чужеродные белки образуются в Е.
со(( в слшдком большом количестве, очень часто процессинг претерпевают не все белки-предшественники: примерно половина секретированных белков сохрас~яет лидерную последовательность, а другая половина полностью процсссируется с образованием зрелой формьс. Это может быть связано с недосгатком каких-то белков, участвуюсцих в секреции.
В такой ситуации, чтобы увеличить долю процессированных белков, можно попытаться повысить уровень экспрессии генов, ответственных за синтез лимитирующих компонентов секретируюшей системы. Для проверки этого предположения бьши поагавлены следуюсдпе эксперименты. Плазмиду, несущую гены (сг(А4 и зесЕ, которые кодируют основные компоненты люлекулярного механизма, ответственно о за физическое перемещение белков через мембрану, ввели в клетки Е.
са(6 После такого усиления секреторного аппарата хозяйской клетки доля рекомбицаспного белка (цитокина интерлейкина- 6), секретируемая в плазмиду в зрелой форме, увеличилась с 50 до более чем 90%. Грибьг Аг(сасхйаз секретируют в среду большое количество ферлсентов и широко используются для их с ~рочышленного производства. В одной из работ осуществили слияние гена человеческого интсрферона с геном сигнальнос о пептида, отвегспкапюго за секрецию, и помсопши эту конструкцию под контроль глюкоамилазного промотора Агрегд(((ас тг(сс(апгь индуцируемого крахмалом. После л обвале ни я посл еднег о в среду с тра нес)юрмировапными клетками Азаегя(((из тс(и(ааз выход секрегируелсо~ о человечсскос о ига ерферона достиг ! мг на ! л, что эквиваленпю примерно 5% всего секре псруе мого клеточного белка.
Эта работа показывает, что стратегии модулирования сенной экспрессии, разработанные для Ь: са((, можно использовать и применительно к другим биологическим системам. Метйболичеекая перегрузка Введение в клетку чужеродной ДНК и ее экспрессия часто приводят к нарушениям клеточного четаболизма. Эти нарушения весьма раз- нообразпы и обусловлены давлением, когорое оказывает чужеродная ДНК на все клеточные процессы. Метаболическая перегрузка может возникать по разным причицач. ° увеличение числа копий сс(сили разксера плазмид и связас и сое с этим увеличение количества энергии, необходимого для их репликации и сохранения. ° Недостаток растворенного кислорода в среде и невозможность обеспечения им и всех метаболических реакпий, и процесса экспрессии плазмидных генов.
Гиперпродукция чужеродных белков, приводящая к истощению пула некоторых аминоацил-гРНК (или даже некоторых амиснькислот) и/или энергетических запасов (в виде АТ!' и СТР). ° Перегрузка системы экспорта и нарушение правильссой локализации жизненно важных белков хозяйской клетки вследствие «перепроизводства» чужеродного белка, экспортируемого пз цитоплазмы к клеточной мембране или в периплазматическос пространство. ° Наличие у организма-хозяина необычных метаболпческих свойств (например, высокая дыхательная активность у А~агаЬасгег зр(х), что делает его более чувствительным к различным воздейсз виялс„чем обычные клетки.
° Непосредственное влияние чужеродс~ьсх белков на функционирование хозяйской клетки (например, превращение с их помосцью важных незаменимых предшествегпсиков в неприемлемые, а иногда и токси шые соединения). Метаболическая перегрузка может привести к разнообразс~ым изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых — снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированныс, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды.
Иссогда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды делстируется рекомбинантньсй ген или его часгь. 128 !ЛАВА 6 таблииа 6.6. Влияние числа копий плпзыиды ни скорость роста хозяйских клеток'1 Оттгоспткеыгии екороегь рости Число копий плазиилы Плазм или ото угет пуог А 1,ОО 0,92 0,91 0,87 0,82 0,77 0 12 24 БО 122 408 В 0 Н Г!олл|ттткм зъботы ьео, ьгттбеу. Г985, ЛтлтееГылГ Лтжлк 27: ~ББ8 ~Б74.
' Пллзмтыы, об тзнелетнтгее букымн Л. В, С, О н Е, колнрултт телеке Р ллкымлзу н лмек т олннкконый рлзмер Плизмилы, гтрзгеугетпугощие и клетках Е. еоя ПВ101зт Поскольку клеткам, растуцгим в условиях метаболической перегрузки, не хватает эцерпти для нормального функционирования, затраыгваются прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слишком много внеклеточного полисахарида, скленваюшего клетки друг с другом и затрудняющего микрофгильтрацию.
Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питагельных всшеств или «строительных блоков»вЂ” аминокислот, может ггроизойти запуск стрессовых механизмов, в частнопги иниг!иироваться синтез клеточных протеиназ, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Истощение пула аминокислот может стать 1тезулшвгом эффективной экспрессии не только кюнированных генов-мишеней, но и генов самого вектора, кодируюших маркеры устойчивости к антибиотикам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
