Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 32
Текст из файла (страница 32)
В одной из работ были сконструированы пггаммы, несущие мутации в одном или даже нескольких пратеиназных генах, и чем более выражен был суммарный дефицит по протеиназам, тем хуже рос ппамм. Таким образам, снижение протеиназной активности приводит к истощению клеточных ресурсов. И все же удалось сазлать штаммы Е.
сой, несущие мутации в гене сигма-фактора РНК-полимеразы, ответственного за синтез белков теплового шока (гроП), и в гене протеиназы, необходимой для роста клеток при высоких температурах (йейР), у которых удельная активность секретируемых белков была в 36 раз вьппе, чем у штаммов дикого типа. Это кажущееся увеличение было обусловлено снижением интенсивности протеолитического расщепления белков. Бантериальный «гемоглобин» Местообитанием некоторых штаммов грамотрицательных облигатных азробных бактерий 'гйгеогсШа являются сильно обедненные кислородом непрогочные водоемы.
Чтобы получать нужное количество кислорода для роста и метаболизма, они синтезируя>т гемоглобиноподобное вещество, связывающее кислород окружакн щей среды и увеличивающее концентрацию доступного кислорода в клетке. Когда ген, кодирующий этот белок, был введен в клетки Е, сой, в последних сразу произошли серьезные изменения: повысился уровень синтеза клеточных и рекомбинантных белков, возросла эффективность протонных насосов, увеличилось количество образующегося АТР и его концентрация, особенно при низком содержании кислорода в среде. Чтобы такую стратеппа можно было ис- Оптимизация экспрессия генов, клонированных в прокариотяческих системах 123 пользовать применительно к другич хозяйским гцхеткам, необходимо, чтобы эти клетки не только эффективно экспрессировали «гемоглоби новый» ген г!ггеозс!!!а, но и синтезировали гем— составляющую гемоглобиновой молекулы.
Это позволит улучшить рост таких важных в коммерческом отношении бактерий, как Е. со)г, ;л!гергоглусез )ЬЫаглг, ОэгупеЬасгепит я!агат!сит и Хаягйотопах ша!Горй!)пб а также осуществлять в них экспрессию чужеродных генов. Инз'еграния чужеродной ДНК в хромосому хозяина При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, мнопжопийные плазмиды требуют больше энергии, чем малокопийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды.
Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых опи сохранились, и в конечном счете оказывакпся в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два полхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечиваю- щих рост только тех клеток, в которых есть плазмида.
Однако добавление антибиотиков и какихто других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приволит к значителыюму улорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам„в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории.
Он должен не юлько оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Вклк>чение клонированной ДНК в хромосомнук1 ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазчидных генов. При встраивании нужного гена в хромосомну1о ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чзобы сайт интеграции не находился внучри гена, кодирукппего важнукз клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный сайт Кроме того, для обеспечения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора.
Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать пуклеотндную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в хромосомной ДН К, в пределах которых и должен произойти физическии обмен (рекомбннация) между двумя молекулами ДН К. Вкратце процесс интеграции состоит в следующем. 1. 1!дентификация полходяшего сайта интеграции, т. е. сегмента хозяйской ДНК, последовательность котороп> может быть прервана без ущерба для функционирования клетки 2.
Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части. 3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайз интеграции (рис. 6.15, А) или вблизи него (рис. 6.15, Б). 4. Перенос полученной генетической конструкции «хромосомный сайт интеграции/клонированный ген» в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина. 5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, которые экспрессируют клонированный ~ен.
Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина. Если клетка трансформирована нереплипируюшейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произоити спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант — интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае„если клонированпый 124 ГЛАВА б Пяяямиги яыя гея Се~я !х)мся хвсм ДНК сомпяя ДНК Кяояярояя~щый гея язмядя егиеяз, омсясгяяный ромоесмиой 1!К емомбяпяцяя Кяенираяяяяий Пяя~мяяпяя ДНК Клояяаояяняый гея ген встроен вблизи клонированного хрохяосомного сайта интеграции.
Для проверки эффективности интеграггии клонированного гена использовали В. зиЬг!!гп Была сконструирована нлазмида Е. сод, содержащая ген а-амилазы (фермента, участвующего в гидролизе крахмала) Вес!!!их глпу!о!!г)ифас!епз, встроенный в середину фрагмента ДНК из В. хиЬг!!!я. Она была неспособна реплицироваться в этом микроорганизме, но ею можно было трансформировать клетки В.
зиЬВ!)к Обнаруженные трансфарманты Рве. 6.15. Дяа способа интеграпии клонирояанного я плазмилс гена в хромосому. А. Ген встроен в серслину клонированного в плазмиде сегмента аб, гомологнчного сегменту а'б' в хромосомной ДНК. В результате двойнога кроссинговера (Х-Х) клонированный ген оказывается в составе хромосомы. Г>.
Гся встроен вблизи клонированного в плазмиде сегмента с, гомологичного сегменту с' в хромосомной ДН К. В результате одиночного кроссинговеря (Х) происходит интеграппя я хромосому всей пяазмиды вместе с включенным я нее геном. синтезировали а-амилазу, что свилетельствуег сб интеграции гена, кодиручоп1сго ллнный фермент, в хромосому В. гиЬг!!!К и о его функционировании. Отобранные рекомбинанты были устойчивгя к амцицнллину и хлорамфениколу. Г(осксльку оба гена устойчивости находились в нлазмиле, было очевидно, что произошла одиночная рекомбинация„в результате которой вся ~нгазмида включилась в хромосомную ДНК В.
хиЬг!!!к Чтобы увеличить число копий гена а-амилазы, локализованных в хромосоме В. зиЬ!у!!г, ис- Оптимизация экспрессии генов„клопнрованиых н прокарнотнческих системах 125 Число копии на генон Лктнянестта ЕД яа 1 нл культуры, находящейся я сереаяаае экснененннатьа|на фала 500 2300 3100 3400 4400 700 2 5 7 8 9 Многоконнйная пдаамнда понесенная ДНК Пяатнндная Д1|К Маркерный ган мосоиная ДНК Пяатмнаная ДНК Ген-мнюепь Хромосомная ДНК ходпые трапсформаиты выращивали в присутствии хлорамфеиикола в высокой коицептрации. В таких условиях выживали тол|,ко тс ктстки, в которых происходила спонтанная дупликация иитегрированиой плазьптды. Клетки, отобрапиыс по признаку усптйчиности к хлорамфепиколу, проверяли иа активность а-амилазы (табл.
6.5). 1!осле такой процелуры были получены клетки, содержащие до 9 копий гена а-амилазы. Уровень фсрмеитвтивиой активности в клетках, содержащих а-амилазиые гены в соствве хромосомь|, была горазло вьппс, чем в том случае, когда эти гены паходщ|ись в миогокопийиой плазмиле (от 20 до 40 копий иа клетку) В. уд!ИИИс В одном из исследований Несколько копий чужеродного |епа было встроено в разные зараисс вь|браииые сайты в хромосоме В. тибИИу, при этом для каждой из копий использовалась двух- этапная процедура (рис.
6.16). На первом этапе Рис. 6.1б. Встраивание чужеродного гена н заранее выбранный са|п в хромосоме В. |ибл!рк На тгапе 1 в хромосомную ЛНК хознйской клетки с помощью гомояогнчной рекомбинации встраивают маркерный ген. 11а этапе 2 маркернын геп замещают геном-мишенью. Аналогичную операцикт понторяют для других сайппв. уаблили 6.5. Свнзь между числом копий гена а-ам||ла- зы н уровне и ее акт износи| в кле псах В..тиЬтд!та > '| Палая|пан Гас|о|и Кмвоа| а|., 19К7 Лррт. Матисе Гяыегяаа| 27| 64 71. выбирали селективный маркерный геи (Например, геи устойчивости к какому-либо антибиотику) и встраивали его в середину вполне определенного, ио несущественного фрагмента хромосомной ДНК В. тиЬИИа в составе |щазмид- 126 ГЛАВА 6 ного вектора, не способного к репликации в этом микроорганизме.
Отбирали клетки, экспрессирующне маркерный ген, т. е. клетки, у которых этот ген включился в хромосомную ДНК. На втором этапе ген-мипюнь с соотвегствукгшими си1шалами инипиации транскрипции и трансляции, введенный в середину такого же, как и выше, песущественного фрагмента хромосомной ДНК )). зибг))й в составе плазмиды, включалп в хромосомную ДНК с помощью рекомбинации, заменив им маркерный ген. Отбирали клетки, которые уже не экспрессировали маркер~ пай ген, т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
