Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 31
Текст из файла (страница 31)
6.13), наруша>ошее связывание мРНК с рибосомой. Именно локальная вторичная структура мРНК, обсспсчивакдцая экраннрование или, напротив, экспонирование сайта связывания рибосомы, и определяет прочность связывания мРНК с комплементарной рРНК. 3 аким образом, при клонировании любого сена важно убедиться в том, чло сайт связь>ванна рибосомы расположен на нужном расстоянии от этого гена и что вторичная структура мРН К пс помешает его присоединениюю к рибосоме. Уже создано большое количество векторных систем, которые включают как трапскрипционный, так и трансляционный сигналы, обеспечивающие экспрессию клонированных эукариотических генов в Е собл Одной из таких систем последовательность нз шести-восьми нуклеотидов (например, НААС>О>АОСз), спаривающаяся с комплементарной последовательностью (в данном случае АЬОССНСС) РНК-компонента (рРНК) малой субъединицы рибосомы. Обычно чем прочнее связывание между мРНК и рРНК, тем выше эффективность инициации трансляции.
Именно поэтому большинство экспрессирующих Е. со!1-векторов конструируют таким образом, чтобы мРНК клонированного гена обязательно содержала сильный сайт связывания рибосомы. Это необходимое условие трансляции гетерологнчных про- и эукариотических генов в Е. со!Б Однако должны соблюдаться и некоторые другие условия. Во-первых, нуклеотидная последовательность, связывающаяся с рРНК, должна находиться на определенном расстоянии от старт-кодона клонированного гена (в РНК старт-кодоном является АШз, в ДНК ему соответствует колон А1О).
Во-вторых, участок ДНК„содержащий сайт свизыва- Приступая к конструнровани>о 1ас-промотора, Де Боер и ею колле>и ставили своей целью создание на основе двух разных сильных регулируемых промоторов еще более сильного промотора, способного обеспечивать высокий уровень экспрессии чужеролных белков. Котла они начинали свои исслелования, нуклсотилные последовательности больщинс>ла црокариспических промоторов, а первую очерель Р. са!1, были уже установлены, однако конкретные свойства, обусловливающие их Фективностзь оставались неизвестными.
Было показано, что почти все мутации, влияющие на силу промотора. локализухпся в — 10- или в — 35-областях(нахоляшихся на расстоянии 10 или соответст»енно 35 и. н. до точки инициации транскрипции). Бо- как раз обратная. Он и его коллеги решили сионе>руировс>ть химернмй промогор, у которого — 10-область происходила бы о> !ас-промогора, а — 35 — от промотора лр. Это> новый, так называемый гаспромотор был проверен на способность коптролиролать синтез Фсрмеша илактокиназы Р.
сай по сравнению с !ас- и лд-промогорами в лаких же условиях. Как и ожилалось, сас-промотор оказался гораздо более сильным — примерно в 5 раз но сравнению с промотором ссд и в 1Π— но срав»ению с !ас. Кроме того, сас-нромотор, как и !ас, реагировал на 1ас-ренрсссор и активировался под действием ИПТГ. Таким образом, новый промотор бьщ не только более сильным, но и регулируемым.
Огп ныизацнн экспрессии генов„клониронанных н прокнрнстнческих системах 121 н у!со! лн! 70!иди ! Рнс. 6.14. Экспресснру!о!ний вектор на основе плазмючы рКК233-2 (без соблюдения масштаба). Он содержит ген устойчивости к аыпнпнллину (Ап!р'), являющийся селектин~ым маркером, гас-прамотар (Р7ас), !осХ-у!ассах связывания рибасамы (гбя), .гри сап!а для рестргщируюших энлануклеаз (А!го!, Руд и ОиЫИ!) н лва сайча термнпнпнн чрапскриппни (Т! и Т2).
Огрелка -- направление транскрипции. является экспресснрующий вектор рКК233-2, солержащий следующие элементы (рис. 6.14): ° селективный маркер устойчивости к ампи- циллину ° !аг-промотор ° 1асХ-участок связывания рибосомы ° старт-кодон АТО, расположенный на расстоянии восьми нуклеатидов от сайта связывания рибосомы ° сайты термина!!ии транскрипции Т1 и Т2 фага ).. Клонируемь7й ген встраивают в Лсо1-, Руг1- или ИлЛП-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосолгы и сайтами терминации транскрипции.
Если ега ралока считывания не попадает «в но! у» с колоном А(>'С, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клоиировннного гена.
Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотилная последовательность, кодирующая )л)-концевой участок белка-мишени, у разных клоннрованных генов неодинакова, нельзя создать универсальный векюр, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому пн одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- рантировать эффективность трансляции всех клонированных генов.
Таким образом, описан. ные выше зкспрессирующис векторы — это только основа лЛя создания оптимальной системы трансляции. Эффективной трансляции может препятствовать и «несовместимость» клеток, обусловленная тем, что в клонируемол! гене имсчотся коЛоны, редко встрсчаюп!исса в !сломе ор7анизма-хозяина.
В таких случаях в хозяйской клетке может пе доставать транспортных РНК (тРНК), узнающих редко используемыс коданы, что снижает выход продукта клонирован ного гена. Как решить эту проблему -- не савсел! понятно. Если продукт клонированного гена очень ценен, можно попытаться химически синтезировать такой вариант клонируемо! о гена, который состоит из кодонов, обычна используемых хозяйским организмом (оптимизация каланов). Стабилизация белков Тобяилс! б.4.
Время полужизни ()-гачакгознлаз, к 1ч- концу которых присоединены разные аминокислоты'! Время пояужнонн 1 !рнсооннненные оно нокнюоты М«7, Зег, А!а тьг, Уа1, О!у !!е, О!и туг, гчо Рсо Рле. 1,«о, Аор. !.уо Ага >20 ч >20 ч >30 мнн — !О ынн -7 мни -3 ынн -2 мнн " по лонным робо!!о аос!япыс «! о!., ржб, З«7«ос«234! !79 — ! 66.
Обычно время полужизни белков составляет от нескольких минут до нескольких часов. Такая вариабельность обусловливается различиями в числе дисульфидных связей в белковых молекулах и наличием или отсутствием на 5 -конце определенных аминокислот. Например, если к )о!- концу р-галсчктазидазы присоединять разные аминокислоты, то время жизни модифицированного белка ш 91!го может варьировать от двух минут до более 20 часов (табл. 6.4).
Аминокислоты, увеличивающие время жизни белков, можно включать в белки геннои~женерными методами. Часто для стабилизации белка-мишени 7!остаточно присоединить к 19-концу всего 122 ГЛАВА б один аминокислотный остаток. Долгоживущие белки накапливаются в клетках, что увеличивает конечный выход продукта. Это характерно как для эу-, так и для прокариот. Однако стабильность белков может не только повышаться. Так, включение некоторых аминокислотных последовательностей во внутреннюю часть белковой молекулы делает ее более чувствительной к протеолитическому расщеплениях Такие последовательности обогащены остатками пролина (Р), глутаминовой кислоты (Е), серина (Я и треонина (Т), отсюда и их название— РЕВТ-последовательности. Они часто бывают фланкированы кластерами из положительно заряженных аминокислот и, возможно, служат маркерами для протеаз.
Стабильность белков, содержащих такие последовательности, можно было бы повыситгч внося изменения в соответствующие гены. Ири этом, однако, необходимо позабавиться о том, «пабы не произошло нарушений функции белка-мишени. Рост в условиях недостатка кислород» Е. сей и многие другие микроорганизмы, которые используются для экспрессии чужеродных белков, обычно расту~ только в присутствии кислорода.
К сожалению, растворимость кислорода в водных средах ограничена, а ~ю мере увеличения плотности культуры содержание растворенного кислорода в культуральной среде быстро падает. Более того, поскольку кислород растворяется очень медленно, эту. проблему нельзя решить простым продуванием через среду воздуха или кислорода даже при интенсивном перемешивании. Ири уменьшении концентрации кислорода экспоненциальный рост замедляется и культура медленно переходит в стационарнута фазу, характеризующуюся другим метаболическим статусом Одним из последствий этого является образование в клетках протеиназ, которые могут расгдепляп белок-мишень. Ироблему аэрапии культуральнай среды пы~ались решить разными способами: изменением конструкции биореактора, |ювьппением интенсивности продувания воздуха и перемешивания, добавлением в среду веществ, увеличивающих растворимость кислорода.
Все это, однако, не привело ни к каким ощутимым результатам. Применение хозяйских штаммов с де4ицитам ~ротеиназ Один из возможных подходов к стабилизации чужеродных белков, синтезируемых Е. сой, состоит в использовании хозяйских штаммов с дефицитом пратеолитических ферментов. Однако здесь есть свои трудности. В клетках Е. сай синтезируется по крайней мере 25 разных протеиназ, и только некоторые из них изучены на генетическом уровне. Кроме того, протеиназы выполняют в клетке очень важную функцию, разруппш чужеродные или дефектные белки и обеспечивая тем самым жизнеспособность клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
