Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 28
Текст из файла (страница 28)
триптофаиа а срелс ген с! транскрибируется и транслируется. репрессор с! связывается с Л"-промотором и блокирует транскрипцию клоиироаанного гена. Б. В присутствии триптофаиа ~он с1 репрессируется, его пролукт пе синтезируется„ поэтому клонированный ген транскрибируется и транслируется. О>пимизация экспрессии генов, клоиироваиных в прокдриотических системах 111 тазы после индукции транскрипции добавлением триптопа прихолится соответственно 21 и 24% от общего количества си!пезируемого белка.
Таким образом, лвухплазмидные системы позволяют получать белковые продукты с пс>могцью рекомбинантных микроорганизмов в промышленных масппабах и относительно недорого. Зобо>иа 6.2. Активность р-пьтахтозидазы в грамотрицательиых бактериях, несущих плазмидный вектор с геном (ас2 Е.сол и гетерологичным промоп>ром'> Аигиднвсть |3 — гадаюваидааы, ЕД Првмвтвр Лгсйепсйт сол ИйиоЬтт тейтвп Л(игоЬ(ит (еяит(иоииит РяеиИотоиеайии (и Отсутствует Мп (ас 110 21 ВОО 9050 2350 3300 16 1400 2000 !! 300 40 !ЗО 13 900 б250 1150 !200 150 !б ЗОО 9ХОО 2950 3350 '> По данным >.авда е! а1., 1990, Свдс 89а 37-46.
Исиользоваиие г)ля экспрессии г)ругих микрооргшаимов Е, соП вЂ” не единственный микроорганизл>, который используется для си>ггеза чужеродных белков. К сожалению, генетические и молекулярно-биологические свг>йства большинства друп>х микроорганизмов изучены не так хорошо. Кроме того, нет ни одного вектора или даже промоторно-репрессорной системы, которая обеспечивала бы оптимальный уровень экспрессии в клетках всех или хотя бы только грамотрицательпьгх бактерий.
К счастья>, многие стратегии, разработанные для Е. соП, пригодны и для множества других микроорганизлюв, что позволило проверить различные промоторы на их способность обеспечивап транскрипцию в других грамотрипательных бактериях. Так, в одном из исследований был сконструирован набор плвзмидных экспрессирующих векторов, содержащих промоторы (ос, (ас, (чш (гена устойчивости к неомицину) и 51 (гена рибосомного белка 51 ПЬ>хоЬ(ип> теП(о((), и определен уровень экспрессии гена 1)-лактамазы под контролем каждого из них (табл. 6.2). Обнаружилось, что: 1) указанные промоторы проявляют ту или иную активность во всех использованных бактериальных системах; 2) промотор (ас наиболее активен в Е соП и гораздо менее — в лругих бактериях; 3) 1>(ш — второй по активности промотор в Е сой и самый активный в других бактериях.
Промоторные участки у всех грамотрицательных бактерий имеют сходную пуклеотидпую последовательность, однако это не означает, по салгым эффекгивыым промотором для того или иного организма будет гот, кспорый наиболее эффективен в Е. соП. Тем не менее Е. соП-промоторы могут оказался вполне приемлемыми для регуляции экспрессии клонированпых геков и в других грамотрицательных бактериях. Попытки создания вуниверсвльногоа экспрессирующего вектора для грамотрицжгельпых бактерии были весьма многочисленными.
В конце концов была выбрана следующая стратегия. Фрагмент ДНК размером 70 и. и., >>роисходящий от одного из концевых инвертированных повторов в транспозоне 5 (Тп5), встроили вместе с соответствующим промотором в ги>лилипкер мщюкопийной плазмиды р>хК290 с широким спектром хозяев и получили плазмиду рЛ>г10 (рис. б5). Клопированный сегмент ДНК из Тп5 содержал два независимых, но перекрывающихся промотора, кажлый из которых необходим для транскрипции олного из клк>чевых Тп5-генов. Поскольку Тп5 эффективно экспрессируегся в разных бактериях, его промоторы можно использовать для транскригщии различных генов.
Чтобы проверить это, в полилинкер сразу зв клонированными промоторами Тп5 встроили гены хлорамфеникол-ацетилтрапсферазы и 1)-галактозидазьг. Их эффективная экспрессия происходила в клетках Л(садяепег вр., Е. соП, Еп(егоЬос(и с(оаеае, К(еЫеПа рпеитоп(ае, Рхеи(оп>опи г хлс(гег(, Рхеис(отопах ((иогехсепх и Еепаг(а гпопехсепк Таким образом, есть реаль- !12 (ЛАВА 6 Тсс' ЛХЛ! Рссс. 6.5. Кюнир>юший вектор РАН!О (без соблюдения масшгаба). 1!Оказано положение сена устойчивости к тетрацнклнну (Те!'), сайта рестрикции для энпонуклеазы ВИЛ(, сайта инициации реплнкации (ол), промотора (р) и полилинкера (Ш!). Встраивание клонироаанного гена в полилинкер ставит его пол контроль промотора сп> (р). Стрелка указывает направление гранскрипции.
ная возможность использовать Тяб-цромоторы для инициации транскрипции чужеродных генов в клетках различных бакзерий. Химерные белки Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживакпся в гетерологичных хозяйских клетках лишь в лсинимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодируннцих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках.
Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конссрукции, получившей название»химерный белок», продукт клонированного гена оказываетси защисценным от расщепления цротеазами хозяйской клетки.
что было показано в холе экспериментов. Слияние белков программируется на уровне ДН К лигированием коли руюи(их участков соответствукпцих генов. В самом простом виде век- тО(7!ш51 система сли5!Иия прел>сматривяет вю!юсенис гена-мишени из!и еп> се1мента в кодирующий участок клоцированноп1 гена-хозяина. Очень важно, пабы РНК. транскрнбируемая с клонированного гена-мишени, имела правильную нуклеотилную последовательностсч обеспечивающую образование продукта клонированного 1еня. Если ири объединении сепчентов ДНК происходит изменение рамки считывания, т.
е. последовательность кодонов детерминирует укороченный или неправильный трансляциопный нродукс, то не сможет образоваться и функционально активная форма белка. Убелиться в правильности рамки считывания можно разными способами. Как правило, для этого необходимо знать точную нуюсеотидную последовательность липсруемьп фрапчентов ДН К. Расщепление химер!с!их белков В зависимости от нрелназначения белкового нродукта клонированного гена оп может исполь.
зоваться как таковои или в составе химерноп1 белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присуп:твия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам прОд>'кт клОнирОваннОГО гена- мишени может Оказаться неактивным. Кроме того, лля химерных белксв предусмотрена более сложная процедура тестирования, котор>ю они должны пройти, *побы получить разрешение к применению у соответствующих организаций.
Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Олин из таких способов основан на присоединении белка, кодируемсно геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержсццему короткии пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. (акое присоединение тожс ссрслрамлсируется на уровне Д1-! К. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты лля цротеаз, можно пришить к клонированному гену до того. как такая коню рукция будет введена в эксцрессирукццую векторную систему. слииния.
Линкером лц1жет служить, например, олигонуклеотид, кодирующий пептид Ве-О!цО1у-Агд. После синтеза и очистки химерного белка для отделении белкового продукта, кодируемого клонировапным геном, можно использовать фактор свертывания крови Хп который является специфической про1еиназой, разрывающей пегп.идные связи исключительно на С-конце носледовательности 11е-О1ц-О1у-Агк (рис. 6.6). Ьолее того, носкольку такой нентид Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах !13 Сейт, узнаваемый АЬс! АЬг! Встраивасл!ый гев АЬ«! 1а«2 Расщепление е помощью А)е! Лигироеени« !а«У АЫ! Встроенный ген е-ыее фактором Х, Линк«рвал -----е-4 ..
Гы-А!е-С!ц-О!у-Бег-!)е-О!в-О!Ь.-А!Х-Уе)-1!!е-ьеа ... Рис. 6.6. Протеолитическое рас!яепленве химерного белка фактором свертывания крови Х„. Фактор Х, узнает амвнокислотну!о последовагельйость, разлсля!ощу!о даа компонента химерного белка. После расщепления высвобождается функциональный белок, кодируемыи клонированным геном. встречается в природных белках довольно ред- ко, этот подход можно использовать лля отделе- ния ми!них дру! их продуктов, кодируемых кло- нированными генами. Применение химерных белков В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовгггтч является сам химерный бед!ок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. г!тобы решить эту задачу, можно встроить в подходя!ций вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
