Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотилов. Синтезируют отдельные олнгонуклеотя- ды данной от 20 ло 60 звеньев каждый с такими нуклеотиднымн последовательносзями„чтобы при отжиге нз ннх образовалась лв> хнепочечная молекула. Оставшиеся одноцспочечные разрывы сшивают с помощью ДНК- лнгазы Тч. ноцепочечные разрывы с помощью ДНК-ли>азы Т4.
Синтетические гены могут быть сконструированы так, чтобы помимо белок-кодирующих последовательностей они содержали концевые участки, обеспечивающие их встраивание в ююнируюший вектор (сайты для рестрицируюших эндонуклеаз), а также, если это необходимо, сигнальные последовательности для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции. Для получения полноразмерных генов другим способом тоже вначале синтезируют специфический набор перекрывающихся олигонуклеотидов длиной ог 40 до 100 звеньев. При их отжиге происходит спаривание 6 — 10 3'- и 5 -концевых взаимно комплементарных нуклеотидов, а между ними остаются большие бреши. Протяженность спаренных участков достаточно велика, чтобы стабилизировать всю структуру.
Бреши заполняют ферментативным путем с помощью ДНК-полимеразы ! ЕкеЬег(с)г!а со(Б использующей 3'-гндроксильпые группы для иниггиации репликации и одноцепочсчные участки в качестве матрицы. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигаз>4 Т4 (рис. 5.! О). Более протяженные гены (Д !000 п. н.) обычно собирают из двухцепочечных фрагментов, каждый из которых в свою очередь состоит из 4 — б перекрывающихся олигонуклеотидов (от 20 до 00 п.
н. каждый). Если после синтеза и отжига образуется достаточное количество фрагментов, то их просто соединяют друг с другом. В противном случае каждый фрагмент клонируют и амплифицируют. Двухцепочечпые фрагменты последовательно соединяют друг с другом до образования полноразмерного гена. Чтобы гарантировать 8й ГЛАВА 5 Синтез олигоиуклсстидоз з Р Он Он Он 4 Р— ОН Р— 1 ОН нО | Заполнение брепгея с помощью ДНК-полямерззы 1 ОН Р НО Гси Р ОН НО Рис.
5.10. Сборка протяженного гена 1п т1гш с участием ферментов. Вначале химическими методами синтези- руют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными послеловательностями, чтобы при отжиме межлу ними образовывались спаренные участки длиной б — 10 пар нуклеотидов. Оставшиеся межиу ними бреши запол- няют с помощью ДНК-полимеразы 1 Е сей, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4. правильность нуклеотидной последовательности химически синтезированного гена, ссквенируют каждый двухцепочечный фрагмент, а затем и весь ген.
ген, часто удается установить его функцию, сравнив сто нуклеотидную последовательность с таковыми для генов, функция которых уже известна. Без данных о нуклеотидной последовательности невозможно проводить исследования по молекулярному клонированию. Секвенирование того или иного фрагмента ДНК можно провести либо химическим методом, разработанным А. Максамом и В. Гилбертом, либо ферментативным, предложенным Ф. Сангером, но в Методы секвеиироввиии ДНК Исчерпываюп бчо инфармацию о молекуле ДНК можно получить, только определив ее нуклеотидную последовательность.
Так, секвенировав Химический синтез, определение нуклестилной последовательности и амплификация ДН К 39 Секвенирование ДНК е помон(ью терминирую!цих лидезоксинуклеотидов К базздег, 3. )4)сй!еп, А. К. Соц1зоп Рюс. 74а)6 Асац Вол Г>ВА 74: 5463 — 5467, 1977 Специфичеекая ферментативная амплификация ДНК 1п у1(го: полнмеразная цепная реакция К. В. Мн!1йч Р. А. Ра!оона, 3. 3.
Всйаг(, й. К. 3а!к(, О. Т. Ного, Н. А. Ег)сй Сон Бриля НагЬог Вуо>Р. Оааог. В!о!. 51> 263 — 273, 1936 раныне секнениронание нуклеиновых кислот сводилось к определению нуклсотилных последовазельностеи РНК. Для этого нужный Фрагмент ДНК сначала транскрибировали н 1'НК с помощью РНК-полимеразы, а затем определили нуклеотилную последовательность послелней. Процедура была весьма сложной и длительной и состояла в следующем: радиоактивно меченнуза РНК обрабатывали различными рибонуклеазами, затем осуществляли хромато>рафическое разлеление образовавшихся пролукюв, повторно обрабатывали их Ферментами, проводили щелочной гилролиз пролуктов второго расщепления, осущесгвлнли хроматографическое разлеление продукта гиаролиза, определяли очередность олигонуклеотидон, основываясь иа перекрывании их концевых участков, и воссоздавали исхолную молекулу. С появлением диаезокси-метола эта процедура практически пересзыа использоваться.
Теперь секвенируют не саму РНК, а ДНК, синтезированную на РН К как на матрице с помощыа обратной транскриптазы, и црименякп неметад14аксама и Гилберта, а метал Сантера, появившийся после того, как была настоящее время наиболее широко используется так называемый лилезоксинуклегпичный метал. гидроксильных групп при углеродных атомах сахарного кольца (рис. 5.
! 1, А). У дезоксинуклеозида, входящего в норме в состав ДНК, отсутствует только 2 -гидроксильпая грутша (рис. 5.11, Б). Удлинение цепи во время репликации ДНК происходит в результате присоединения очередного нуклеозидтрифосфата к 3 -гидроксильной груп- Дидезокецг)уклеотидиый лгешод секвенироваиил ДИК Дидезоксинуклеотцд — это полученный искус- ственным путем нуклеотид, лишенный 2'- и 3'- Созлание новых меголон — это необходимая предпосылка развития любой отрасли науки.
Они позволяют получать недоступную прежде информацию, чта в свою очерню принолит к более глубокому пониманию суп> наблюдаемых явлений и стимулирует дальнейп>ис исследования, порождающие новые открытиз>. Что касается зяалекузгярнайз биотехнологии, то ее основой ешли такис мощные методы, как секнениронание ДНК и ПЦР. Определение нуклеотидной послеловательности ДНК методом ферментативного копирования с осзнновкой удлинения цепи, осущесгвляелюго ДНК-полимеразой, — быстрый, относительна просюй, нелорогой и надежный метод.
Помимо того что нуклеотидная последовательность фрагмента ДН К является его исчерпывающей харакзеристикой на молекулярном уровне, она позволяет также идентифицировать его кодирующую обласзь, подобрать потенциальные ираймеры лля ПЦР, выянить мутациониые изменения в гене. До появления в 1977 г. лидезоксиметола Сантера для !секаениронания ДНК использовали метал сайт-специфического химического расщепления цепи (А. М.
Махаю, 34>. О!!бег!, Рюс. Ага!!. Асан ,>сй С%А 74: 560 — 564, 1977). А еще создана сгзс>еь>а клонирования на основе фага М13. Возможность прямого секнснирования ДНК произвела настоящую революцию в исслеловании молекулярных основ различных болезнен >еловека и н разработке методов их лиагиостики и лечения.
Огромное влияние иа многие области исследований, н гом числе и на молекулярную биотехнологию, оказала разработка метода ПЦР (Кагу Ми!!ия ().3. рагеп) 4,633,202). С возможностью подучения больших количеств ДН К амплификацией сегментан кюнированной или геномной ДНК была решена проблема клонирования ДНК-копий редких молекул мРНК, скрининга геномных библиотек, ныз>аления генных м). и" ций, физического картирования хромосом и з. л. Первым практи >вским применением ПЦР было созлание тест-системы Лля диагностики серповидноклеючной анемии (бн)с! е! а!., 5сгеисе 230: 1350 — 1354, 1935). П Ц Р вЂ” это уникальны метолика, равных которой нет среди лругих хорошо известных методов. Начиная с 1936 г. с ее помощью выполнено более Н) 000 исследований, и несмотря на их огромное разнообразие, перспективы использования ПЦР представляются еше более впечатляющими. 90 ГЛАВА 5 А о о о 11 11 11 О Р -О Р- — Π— Р О СН2 Основание 1 1 О О О Н Н Н Н О О О 11 11 11 ΠР— Π— Р— Π— Р— Π— СН2 Осиоваиис ! 1 ! О О- О О Н Н Н,, Н ОН3 2Н Рис.
5А1. А. Дидезоксинуклеотид (отсутствуют 2'- и 3'-гндроксильиые группы а кольце). РЬ Дезоксинуклеотид (отсутствует только 2"-гидроксильная группа). пе последнего нуклеотида растущей цепи (рис. 5.12). И если таким очередным присоединяемым звеном является дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК останавливается, поскольку следующий нуклеотид нс может образовать фосфадиэфирнуку связь (рис. 5.13). Остановка синтеза ДНК вЂ” это ключевои этап дидезокснметода, но чтобы осуществить секвснированне в полном объеме, необходимо выполнить целый ряд условий.
Первый шаг стандартной процедуры дидезокси-секвенировання состоит в гибридизации синтетического олигонуклеотида длиной ! 7 — 20 звеньев со специфическим участком одной нз цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
