Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 21
Текст из файла (страница 21)
5.2. Комплекс, с которого начинается химический синтез цепи ДНК. К 5'-гилроксильной группе лезоксирибозы первого нувлеозаща присоединена лиметокситритильная (ДМТ) группа, а к 3'-гидроксиньной гругше — сне йсернав молекула. Последняя в свою очередь связана с твердым носителем (пористым стеклянным шариком). свою очередь защищена метильным остатком (рис. 5.3). Такая молекулярная конфигурация и называется фосфорамидитом. Цикл начинается после присоединения первого нуклеозида к стекляному шарику. Далее колонку обильно промывают каким-либо безводным реагентом (например, ацетонитрилом), чтобы удалить воду и другие нуклеофильные вещества„н продувают через нее аргон для вытеснения ацегонитрила.
Затем с помощью трнхлор- Рис. 5.3. Структурная Формула Фос<рорамилигв. Та- кие производные всех четырех оснований — А, Т, О н С вЂ” используются для химическою синтеза ДНК, ДМТ вЂ” лиметокситритил, Ме — метильная группа. уксусной кислоты (ТХУ) отщепляют 5 -ДМТ (детритилирование) от присоединенного нуклеотида, с тем чтобы высвободить (экспонировать) реакционносцособную 5'-гидроксильную группу (рис. 5.4). Колонку вновь промывают ацетонитрилом для удаления ТХУ и продувают через нее аргон для удаления ацетонитрила. Процесс запрограммирован таки и образом, чтобы на втором этапе в колонку одновременно вводились следующий нуклеознд (в виде фосфорамидита) и тетразол (активация и присоединение).
Тетразол активирует фосфорамидит, так что 3 -фосфитная группа образует ковалентную связь с 5'-гидроксильной группой первого нуклеознда (рис. 5.5). Невключившийся фосфорамндит н тетразол удаляют продуванием аргона. Поскольку но окончании первого этапа не все фиксированные на носителе нуклеозиды оказываются связанными с фосфорамиднтом, необходимо предотвратить их взаимодействие с нуклеозидом, добавленным на втором этапе. Для этого нсцрореагировавшую 5'-гилроксильную группу ацетилирукгт с помощью уксусного ангидрида и диметиламинопиридина (кэпнирование) (рис. 5,б).
Если этого не сделать, то уже после нескольких циклов синтезирусмые олинзнуклеотиды будут различаться как по длине, так и по нуклеотидной последовательности. Фосфиттриэфирная связь, образовавшаяся на втором этапе между нуклеотидами, нестабильна и может разорваться в нрисутствии кнс- Хньщческий синтез, определение нуктеотидной послеловатсльности и амнлификапия Д1 1К ВЗ лтг: — О ! Сна Основание 1 НО ! Сна Основание! ~д~ Дстригилирование О Н / Спейсер О Н / Спенсер Рис. 5.4.
Детритилирование — отщсплсние 5 -димстокситритильной (ДМТ) группы с помощью чрихлоруксусной кислоты (ТХУ). Си каг!нный шарик Стеклянный парик ш11 — О ( СН Основание 2 ~1г — О ) Основание 2 НО ( СН2 Основание 1 н н О Н ! Спейсср Стеклянный з шарик пение ' М'1 — О СНз Основание 2 ( Ме — Π— Р О ! СН, Основание 1 Спейсер Стеклянный 2 /,,2 шарик О Н / Ме — Π— Р Н, Н СН С СН Н,С ( СН СН Рис. 5.5. Активапия и присоелиненис. 3 -фосфитная ~руина акгивированного фосфорамидита образует ковалснтную связь с 5'-гидроксильной ~руппой фиксированного на стеклянном шарике лстритилированно~ о нуклеозипа. ДМТ вЂ” диметокситритильная группа, Ме — метильная трупик О Н / Ме — Π— Р НЭ Нг СН Н,С СН СН М' О Н Ы О Н 84 ГЛАВА 5 Кзп ! 1спрореаги ревевший яуклоозил НО ! СН Основание 1 ! СНт Осиовзиие 1 Ы О Н / Спсйсер Пористый -стекчяпныти шарик Кзппироваиие О Н Спейсер ч Пористгяй - стеклянный шарик цитозин и аденин содержит загцищенную аминогруппу, а на 5'-конце последнего нуклеотида находится ДМТ-группа.
Метильные группы удаляют с помощью химической обработки непосредственно в реакционной колонке. Затем отсоединяют олигонуклеотиды от спейсерной молекулы вместе с 3'-гидроксильным концом и элюируют их из колонки; далее последовательно удаляют бензоильные, изобутирильные н ДМТ-группы. 5'-конец цепи фосфорилируют ферментативным (пол инуклеотидкиназа Т4+АТР) или химнче- и! г! — О ! СНт Осиояаяие 2 СНт Осиоааиие 2 Н О ! О= Р— ОМе ! О ! Осиояаиис ! О Н / Р— ОМе ! О ! СНт Осиоваиие ! Окисление О Н / Спейсер О Н / Спсйсср Порисп 1й стскляииый шарик т Пористый стекляипый шарик лоты или !делочи. Поэтому фосфиттриэфир окисляют с помощью полной смеси ло более стабильного пятивалснтпого фосфатгрнэфира (рис.
5.7). Затем промывают ко!!онку и повторяют весь цикл (детритилирование, активация и присоединение, кэппиронание, окисление; рис. 5.!). Все описанные операции проводят до тех пор, пока к растущеи цепи в соответствии с программой не присоединится последний нуклеознд. Синтезированные олнгонуклеотнды связаны со стеклянными шариками; каждый фосфаттриэфир несет метильную группу; каждый гуанин, Рнс. 5.6. Кэппирование.
Свободные 5— пчлроксильныс группы нспрорсагировавцпчх в первом цикле летритилированных пуклеозилов апетилируют, чтобы предотвратить их участие в следующем цикле. Рис. 5.7. Окисление. Фосфиттриэфир окнсляется ло пятивалентного фосфвттрнэфнра, гго приводит к стабилизации фошроднэфирной связи и делает ее более устойчивой к действию кислот и шелочей. ДМТ вЂ” лиметокситритильиая группа, Ме — метильнвя группа. Химический синтез, определение иуклеотилиой послеловательиости и нмплификнцин ДНК 85 таблица.
5.1. Срелний вн!хол олигоиуклеотилов знлаииой длины (н) при разин!х значениях средней эФФективности цикла Эфф»нтннннстл, »» Средний ними, % »=20 »=40 а=60 н=вв а=100 0,02 0,003 1,7 0,6 20 13 45 37 67 61 12 1,5 0,1В 36 13 4 6 67 45 30 02 67 55 90 В2 74 ским метолом. Зту реакцию можно проводить и тогда, когда олигонуклеотнд еще связан с носителем, но после детритилирования. Чтобы выход продукта был достаточно высок„эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быль не ниже 98%. Зффективность контролируют спсктрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например.
при синтезе 20-членного олигонуклсотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,9920 !00) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60- члснный олигонуклеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуклеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов.
А сели средняя эффективность цикла нс превьппает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмь! — изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удастся достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле.
Поскольку все «неудачные» последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. Прил!еиеиие спнтезцровп>шых олигоиуклеошидов Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймсров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. 1.
Нуклеотидпую последовательность специфических олигонуклсотидных зондов (Ллиной 20 — 40 звеньев) находят из ланных об аминокислогиой последовательности ссютветствующих белков. 2. Для получения линкеров синтезируют олигомерь1, которые представлянзт собой палиндромные одноцспочечпые нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизуюшиеся) между собой. Линкеры солержат сайты узнавания для рестрицирующих эндоцуклеаз, что позволяет осу1цествлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б).
Короткий дуплекс длиной 6-12 пар пуклеотндов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом.
3. Один из вариантов линкерных последовательностей, так называемые «адапторы», час- 86 ГЛАВА 5 1 О4 ОН 5'~ г 3' СААТТС ,СТТААС 3' 5' ОН РО, РО. „,81 ОН 5А ° °,, /3' С:СААТТСС С С Т ТААС С 3'/ ' ОН РО Вот Н ге 5омг липкой конец 5'' .."' /3' САТССССССС' гг У ° СССССС'СТАС 5. 7 Латнг- ОН РОл липкий конец Ряс. 5.8. !'нпичные линкеры и адаптор. А. Вгой1-линкор, сосгаящий из 6 плр нуклеотидов. Б. Есок!-линкор из 8 пар нуклеотнлов. В. ВатН1-Вна1-адаптор с ВатНГ-лнпкнмн концами и сайтом узнавания лля Юта!.
то содержат сайты для лвух и более рестрицируюших эндонуклеаз (рис. 5.8, В). С их помощью можно встраивать кДНК в вектор лигированием гю тупым концам, а затем вырезать, используя другую рсстриктазу. Адаптор, изображенный на рис. 5.8, В, встраивагот в ВапгН1-сайт вектора ггеред включением ДНК-мишсни в Лта1-сайт гго тупым концам. После клонирования кДНК вырезают из вектора с помощью рестриктазы ВапйП. В этом случае вектор нс должен содержать Вгпа1-сайтов, и ни вектор, ни кДНК не должны нести ВатН1-сайтов. 4.
Одноцепочечные олнгонуклеатилы из -17-.24 звеньев используют в качестве праймсров при секвецировании ДНК и провсде- . Пир. 5. Одноцепочечные олигонуклсотиды используют в качестве праймерав для сайт-специфического мутагепеза гп гг(гго. 6. Необходимость в химическом синтезе нуклеотггдной последовательности, кодируюшсй какай-та конкретный белок, может возникнуть тогда, когда клонирование соответствующего гена затруднено. При этом нуклеотидную последовательность гена находят из данных об аминокислотной последовательности белка.
К химическому синтез>' прибегакгт и тогда, когда кодоны, из которых состоит данный ген, плохо считываются организмом-хозяином, и уровень трансляции оказывается очень низким. В таком случае можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодаков), при котором аминокислотная последовательность кадируемого белка остается прежней, а колоны считываются хозяйским организлюм более эффективно. Сиггпгез генов Если химически синтезированную двухцепочечную ДНК предполагается использовать в качестве гена или его фрагмента, то каждую из ее цепей синтезируют отделыю.
Получить короткие гены (60 — 80 п. и.) техцнчески несложно: для этого синтезируют комплементарные цепи и затем отжигают их. В случае крупных генов (>300 п. н.) приходится применять специальные стратегии, поскольку эффективность каждого цикла химического синтеза никогда не достигает 100%. Например, если ген состоит из 999 пар нуклеотилов, а эффективность каждого цикла равна 99%, то доля полноразмерных одноцепочечных ДНК по окончании пропесса составит не более 0,004%. Чтобы решить эту проблему, синтетические (двухпепочечныс) гены собирают из модулей — (одноцспочсчных) фрагментов длиной от 20 до 100 нуклеотидав. Один из способов конструирования синтетического гена заключается в получении набора олигонуклеотидов длиной 20 — 60 пуклеотилов каждый с иерскрываюшимися концами.
Нуклсотидные последовательности цеггей задают так, чтобы после отжига концевые сегменты гена имели тупыс концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие 3 - и 5 -концы, комплементарные таковым соседнего сегмента (рис. 5.9). После сборки гена остается сшить ол- Химнческяй синтез, определение нуклеотидной послеловаз ельностн и ам нлнфикацня ДНК 87 | Синтез аглеяьных цепей 3 5 Р— — — — — ОН Р вЂ” — — — — ОН 1 4 Р "— "" — -"- — '"- ОН Р "— '- — — — ОН 2 ОН Р ОН Р "~щтг~>, Г( д щ щЩ!! ~'Ятей ~ 2 Р" ОН 4 Р' ОН 6 ЙНК-ля газа Т4 | Ген Ряс. 5.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
