Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Однако, как показали исследования, ни одна из них не может гарантировать получение аутентичного белка любого гена. По этой и ряду других причин были разработаны системы экспрессии генов с использованием клеток насекомых и млекопитшопгих. Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются лве их формы. Одна представлена отлельными вирионами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило клетки средней кишки, и способны инфнцировать лругие клетки этого органа.
Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сима структура — полиэдроном. Синтез полиэлрина начинается через 36-48 ч после инфекции и продолжается 4 — 5 суг, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации нх защищает белковый г44 ГЛАВА 7 матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такукг части ну, то полиэдрин солюбнлизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.
Промотор гена полиэлрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с послслукгщей инокуляцией полученным рекомбинацтным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтеззу большого количества гстсрологичного белка, который благоларя схолсгву систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопигакгщих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который ингсресуст исследователя. Исходя из этого на осг гово бакуловирусов были разработаны векторы д,ш экспрессии генов, колирующих белки млекопитающих и вирусов животных.
Наиболес широко используется вирус множественного ядерного полиэлроза Аигоегорйа са(г7описа (АсМг" (РЧ). Этот бакуловирус инфицируег более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий. Линии клеток, обычно использукицисся для работы с рскомбинантным АсМХРЧ, получают из гусениц йрогйгргега )гиег)гегг(и. Промотор гнглиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка. Сисгггема эксггрессируюгг(их векторов на основе бакуловирусов Первый шаг в конструировании рекомбинантного бакуловирусаАсМгчРЧсостоит в созданиитранспортною вектора.
Транспортный вскгор — это произволная плазмиды е'. сой, содержащая фрагмент ДНК АсМ)ч РЧ (рис. 7.3), который включает: ) ) промоторную область и расположенную перед ней последовательность ДНК АсМ)м(РЧ, необходимую для гомологичной рекомбинации с АсгЧН'(РЧ; 2) сайт для клоггироваггия; 3) сайт терминаци и-полиаденилирования гена пол иэдрина и прилегающую к нему последовательность ДНК АсМ(ч РЧ вЂ” вторую область, обеспечивающую гомологи гную рекомби нацию с Ас МХРЧ (рис. 7.8). Кодирующая последовательность гена полиэдри- Вемг ерная Д Н К 5'-АсМЫРЧ Рр СК Рг 3'-АсММРЧДНК дик Рис.
7.8. Схематичеслое представление единицьг экспрессии транспортного вектора на основе бакуловврусов (АсМгЧРЧ). Ген белка-мишени встраивамл в сайг клонировании (СК) между промгггтором гена полиздрипа (Рр) и сайтом термииации его транскрипции (Рг). Перед промотором и после саята терминации транскрипции встраивают фрагменты ДНК АсМ(ЧРЧ (5'-АсМ(ЧРЧ ДНК и 3'-АсМ)чРЧ ДНК соответственно), обеспечивающие инте~рацию единицы экспрессии в ДН К АсМ г РЧ за счет гомологичяой рекомбинации в клетках насекомого. на из этою фрагмента удалена.
Интересующий исследователя ген встраивают мсжлу промотором в сигналом тсрминации гена полиэдрина и вводят конструкцию в е. сей. Культуру клеток насекомого, трансфицированную ДНК АсМг(РЧ, трансфнцируюг затеи транспортным вектором, несущим клонироваиный ген. В некоторых дважды трансфицированных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированпый юн вместе с промотором и сиышлом терминации транскрипциии гена полиэлрипа встраивается в ДНК АсМ гч РЧ(рис. 7.9), замегцая ген полиэдрина. Вярионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточггого лизиса, из которых можно выделить рскомбинантный бакуловирус. Визуальная идсгпификация зон лизиса — угомгпельная и субъективная процедура.
Вместо нее дги обнаружения рекомбинаптных бакуловирусов можно испольювать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (П((Р). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних сталий литического ггикла, поместить ген 1асУ Р3 сой, кодирующий ()-галактозидазу, и такую конструкцию включип во фрагмент ДНК, встраивающийся в геном АсМНРЧ, то в присутствии хромогеннопз субстрата (3-галактозилазы зоны с рекомбинантнымя вирусами окрасятся в синий цвет. Гстерологичный белок, синтезируемый культурой клеток насекомого-хозяина, зараженной Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотнческнх систем !45 гетерологичных белков, при этом более 95% из них имели правильные посп'рансляционные мо- дификации (рис.
7.10). транспортный вектор Получение рекодтбинантных бакулоеирусое Исходная методика получения рекомбинантных бакуловирусов в дальнейшем была изменена по ряду причин. Во-первых, применение промотора гена полиэдрина имеет ограничения: белки, синтезирующиеся на поздней стадии литического цикла, часто оказываются людифицированными не до конца. Для решения этой проблемы промотор гена полиэдрина заменили одним из сильных промоторов АсМХРУ, активно функционирующих с самого начала и до конца литического цикла.
Во-вторых, линеаризация генома АсМХРЧ перед трансфекцией клеток насекомого увеличивает долю зон лизиса с рскомбинантными вирусами. Расщепление генома АсМХРУ в одном сайте уменьшает число зон с нерекомбинаитными вирусами, потому что линеаризованные геномы бакуловирусов обладают ограниченной инфицирующей способностью. В результате двойного кроссинговера между линеаризованной ДИК АсМ(ь(РЧ и кольцевым транспортным вектором образуется замкнутая кольцевая молекула, которая обладает инфицирующей способностью. Чтобы обеспечить стабильную линеаризацию в каждом эксперименте, в геном АсМ1ь1РУ дикого типа в ген полиэдрина встроили уникальный сайт для рестриктазы;Ви361.
В результате доля зон лизиса с рекомбинантными бакуловирусами увеличилась с <1% (когда использовались нерасщепленные кольцевые молекулы АсМХРЧ) до примерно 30%. РР Клонироаанный ген Р! Рис. 7.9. Замсшеыие гена полиэдрина АсМ1з!РУ еди- ницей экспрессии транспортного вектора в результа- те двойного кроссинговера в 5'- и 3 -фрагментах. рекомбинантным бакуловирусом, можно выделять через 4 — 5 сут. С помощью системы экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов уже получено более 500 различных Зритропоэтин С-белок-сопряженные рецепторы Белок оболочки Н !Ч- ! Белки капсида НБЧ Щелочная фосфатаза человека ДНК-полимераза и человека 1!плаза поджелулочной железы человека Гена!тлкпинин вируса гриппа Интерлейкин-2 Белок вируса Ласса о.-Интерферон Адснозинлезаыиназа Антиген вируса сибирской язвы ~редшественник б-аыилоида Б-Интерферон Бычий родопсин Анти!си вируса синего языка Регулятор проницаемости мембран, нарушения в котороы приводят к муковисццаозу Антнген вируса денге типа ! Белки вируса малярии Мышиные моноклональные антитела Белок — переносчик лекарственных веществ Белки полионтруса Гликопротеин 50 вируса псевдобешенства Гликопротеин вируса бешенства Ацтиген респираторно-синцитиального вируса Антиген капе!тая ротавируса обезьян Активатор тканеаого плазииногена Рис.
7.10. Некоторые рекомбннантныс белки, синтезированные в системе экспрссснрую!цих векторов на осно- ве бакуловирусов. Н1Ч-! — вирус иммунодефицита человека 1 типа! НЯУ вЂ” вирус простого герпеса. 146 ГЛАВА 7 Синтез )3-глобина кролика в культуре почечных клеток обезьяны, инфицированных рекомбинантиым ЯРО й. С. Мвйяап. В.
Н. Но>гагг1. Р. Вега 1>а>иге «77> 108 — 114, 1979 в векторы млекопитак>щих на основе Я"»40 было встроено множество разных генов, однако после введения их в хозяйские клетки зрелые Функциональные мРНК не обнаруживались. Муллиган и др. встроили кДНК 13-глобина кролика в один из генов аЪ40, из которою бьша удалена почти вся кодируюн>ая область, но который солержал «все участки, отвечаюв>ие за инициацию и терлеинапик> транскрипции, сплайсинг и полиаденилирование...» В клетках, трансфицированпых этой генетической конструкцией, синзезировались и мРНК рглобина кролика, и белок. По Взи361-систему линеаризации далее модифицировали так, чтобы получить сверхвысокую частоту рекомбинантных бакуловирусов.
Для этого в геном АсМХР>! внесли два Вуи361-сайта, по одному с каждой стороны гена полиэдрина (рис. 7.11). Один сайт находился в гене 603 (открытая рамка считывания 603 [ОКГ603)), а второй — в одном из генов (ОКН 629), необходимых для репликации вирусной ДН К.
При трансфекции клеток насекомого с помощью ДНК модифицированно> о бакуловируса, инкубированного с Вви361, рспликация вируса не происходила, поскольку отсутствовал фрагмент необходимого для этого гена (ОКН629). Далее бьш создан транспортный вектор, содержащий ген-мишень и, если это нужно, селективный маркерный ген между интактной копией гена 603 и необходимым для рспликации геном. Таким вектором трансфицировали клетки насекомого, которые были предварительно трансфицированы линеаризованной ДНК АсМ)чРЧ с делецией участка между Взи361-сантами. В резулшате двойного кроссннговера восстанавливалась функциональная форма ОВГ1629 и происходило включение клонированного гена в геном АсМ)>1РЪ' (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
